劉樹雄，何 建

(上海東方肝膽外科醫(yī)院 急診科，上海200438)

急性肝臟損傷的發(fā)病機(jī)制有很多種[1]，包括多種細(xì)胞類型，細(xì)胞過(guò)程，分子介質(zhì)和調(diào)節(jié)因子[2-5]。線粒體損傷和功能障礙在急性肝臟損傷的發(fā)病機(jī)制中起決定性因素，尤其是肝臟小管上皮細(xì)胞的損傷和死亡[6,7]。線粒體自噬是線粒體質(zhì)量控制的重要機(jī)制，通過(guò)自噬選擇性去除過(guò)量和有缺陷的線粒體。線粒體自噬除去受精卵中精子衍生的線粒體以確保母體線粒體DNA的遺傳，并調(diào)整發(fā)育紅細(xì)胞中線粒體的清除[8-10]。線粒體自噬通過(guò)自噬途徑鑒定并標(biāo)記受損或功能失調(diào)的線粒體。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，線粒體自噬包括調(diào)節(jié)自噬誘導(dǎo)和受損線粒體激發(fā)，從而選擇性自噬識(shí)別[11,12]。本研究即探究pink1-prkn PARK2通路與線粒體自噬和肝臟急性缺血再灌注損傷的關(guān)聯(lián)。

1 材料和方法

1.1動(dòng)物模型的制作

C57BL/6小鼠(8至10周，雄性)購(gòu)自中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(上海，中國(guó))。pink1-KO和park2-KO小鼠按照先前描述得到。將Pink1-KO小鼠與Park2-KO小鼠雜交以產(chǎn)生Pink1Park2 double-KO小鼠。戊巴比妥(50 mg/kg)麻醉后對(duì)小鼠進(jìn)行監(jiān)測(cè)和維持體溫至約36.5℃。通過(guò)側(cè)面切口暴露肝臟蒂進(jìn)行雙側(cè)夾閉以誘導(dǎo)30分鐘的缺血，釋放夾子進(jìn)行再灌注。

1.2方法

1.2.1組織病理學(xué) 使用DICT-500試劑盒(南京碧云公司)測(cè)量血清肌酸酐以檢測(cè)肝臟功能。將肝臟組織用4%多聚甲醛固定，包埋在石蠟中，并切成4 μm厚。

1.2.2SP3的免疫組織化學(xué)染色 將石蠟包埋的肝臟切片脫石蠟并在65℃和pH6.0條件下用0.1M檸檬酸鈉溫育用于抗原修復(fù)，用VECTASTAIN○RABC標(biāo)準(zhǔn)試劑盒(Vector Laboratories，PK-4000)和DAB過(guò)氧化物酶底物試劑盒(Vector Laboratories，SK-4100)顯示抗原-抗體復(fù)合物的信號(hào)。載玻片用DAPI(Sigma-Aldrich，D9542)復(fù)染。通過(guò)相差顯微鏡檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞染色。

1.2.3干擾RNA轉(zhuǎn)染 siRNA寡核苷酸的序列如下：PINK1 sI-RNA，5′-ccaggctgggccgcaggaccg;PRKN sI-RNA，5′-ggatcagcagagcattgttca;對(duì)照sI-RNA，5′-uucuccgaacgugucacgu。使用Lipofectamine 2000試劑(Thermo Fisher Scientific，11668019)，用質(zhì)粒DNA或RNAi瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞。

1.2.4ATP耗竭 HK-2細(xì)胞用磷酸鹽緩沖鹽水(137 mM NaCl,2.7 mM KCl,10 mM NaHPO4,and 1.8 mM KH2PO4,pH 7.4)清洗，然后在含20 mM CCCP的無(wú)糖RKRB緩沖液(115 mM NaCl,1 mM KH2PO4,4 mM KCl,1 mM MgSO4,1.25 mM CaCl2,25 mM NaHCO3,pH 7.4)中2-6 h誘導(dǎo)ATP耗竭，在正常培養(yǎng)基中恢復(fù)2 h模擬再灌注。

1.2.5細(xì)胞凋亡分析 根據(jù)制造商的說(shuō)明使用原位細(xì)胞死亡檢測(cè)試劑盒應(yīng)用于TUNEL分析。用熒光顯微鏡檢測(cè)核DNA碎片的陽(yáng)性染色。為了定量，從每個(gè)組織切片中選擇10個(gè)代表性的區(qū)域并評(píng)估每平方毫米 TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞的量。

1.2.6線粒體分離和量化 從肝臟缺血再灌注和假手術(shù)對(duì)照小鼠收獲肝臟皮質(zhì)和外髓質(zhì)，測(cè)量線粒體DNA含量。

1.2.7測(cè)量HK-2細(xì)胞中的線粒體ROS 37℃下HK-2細(xì)胞與10 μM DHE在潮濕且黑暗的室中溫育30分鐘，然后用DAPI(Sigma-Aldrich ，D9542)復(fù)染。利用共焦顯微鏡獲得熒光圖像。為了量化，使用ImageJ software測(cè)定10個(gè)隨機(jī)光學(xué)切片內(nèi)近端肝臟細(xì)胞核中的熒光密度。

1.2.8免疫印跡分析 在SDS-聚丙烯酰胺凝膠上分離，在被轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上后，用5%脫脂牛奶封鎖并用探針探測(cè)一抗和辣根過(guò)氧化物酶綴合的二抗(Thermo Fisher Scientific，31430和31460)。用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑盒(Thermo Fisher Scientific，32106)顯示抗原。ACTB或PPIB用于監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)加載和轉(zhuǎn)移。為了定量，利用ImageJ軟件(NIH)分析蛋白質(zhì)帶。

1.3統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件；計(jì)量資料采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，組間比較用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用百分率(%)表示，比較采用χ2分析；P<0.05代表差異有統(tǒng)計(jì)意義。

2 結(jié)果

2.1線粒體吞噬是由HK-2細(xì)胞中的ATP耗竭

在免疫印跡分析中，ATP D-R誘導(dǎo)LC3B-Ⅱ的快速增加和SQSTM1(圖1的A-1C)的顯著下降，自體吞噬激活的2個(gè)生化標(biāo)志。ATP D-R期間LC3B-Ⅱ和SQSTM1的變化與線粒體內(nèi)膜蛋白TIMM23的顯著減少和 TOMM20相關(guān)聯(lián)(圖1)。

圖1 在HK-2中誘導(dǎo)線粒體自噬以應(yīng)對(duì)ATP耗竭-補(bǔ)充

2.2HK-2細(xì)胞中，PINK1和PRKN/PARK2參與ATP耗盡-補(bǔ)充誘導(dǎo)的自噬

針對(duì)ATP D-R，HK-2細(xì)胞顯示PINK1和PARK2的表達(dá)顯著增加(圖2A和2C)，這表明PINK1-PRKN/PARK2途徑對(duì)ATP D-R反應(yīng)的肝臟細(xì)胞線粒體自噬起關(guān)鍵作用(圖2)。

圖2PINK1和PRKN/PARK2參與ATP耗盡-補(bǔ)充誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞自噬

2.3PINK1或PRKN的沉默使HK-2細(xì)胞對(duì)ATP耗竭-補(bǔ)充誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡敏感

HK-2細(xì)胞中，無(wú)論P(yáng)INK1和PRKN的狀態(tài)怎樣，對(duì)照條件下的凋亡都是最小(圖3)。

圖3 PNK1和PRKN的沉默使細(xì)胞對(duì)ATP耗竭誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡敏感

2.4肝臟缺血再灌注誘導(dǎo)小鼠近端肝臟細(xì)胞的線粒體自噬

收集肝臟皮質(zhì)組織進(jìn)行免疫印跡分析，肝臟I-R誘導(dǎo)LC3B-Ⅱ、PINK1和PARK2的顯著增加，伴隨TIMM23和TOMM20的顯著降低(圖4)。

圖4 小鼠腎缺血再灌注后近端腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生線粒體吞噬

2.5肝臟缺血再灌注誘發(fā)更嚴(yán)重的Pink1和(或)肝臟損傷Park2-缺陷小鼠

活化CASP3的免疫組織化學(xué)染色也顯示突變肝臟中活化的CASP3陽(yáng)性肝臟細(xì)胞多于WT肝臟。TUNEL測(cè)定和激活的CASP3染色均證明肝臟I-R后pink1和park2單敲除或雙敲除小鼠具有高水平的肝臟細(xì)胞凋亡(圖5、圖6)。

圖5 Pink1和/或Park2缺陷惡化肝臟缺血再灌注引起的肝臟損傷

3 討論

自噬誘導(dǎo)已經(jīng)在多個(gè)急性肝臟損傷實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭械靡宰C實(shí)。自噬抑制劑增強(qiáng)急性肝臟損傷而自噬活化劑顯示出保護(hù)作用，這表明自噬在該疾病狀態(tài)的肝臟保護(hù)作用。自噬的保護(hù)作用，尤其是對(duì)肝臟細(xì)胞的保護(hù)作用，通過(guò)自噬缺陷小鼠模型的測(cè)試進(jìn)一步確定。盡管有這些研究，但細(xì)胞自噬是如何保護(hù)急性肝臟損傷肝臟細(xì)胞仍未可知。目前，該領(lǐng)域至少有兩種思想來(lái)解釋自噬的細(xì)胞保護(hù)作用。第一，自噬和細(xì)胞死亡共享信號(hào)通路，自噬的激活可能影響細(xì)胞死亡。這方面一個(gè)很好的例子是BECN1，其通常結(jié)合BCL2，但細(xì)胞應(yīng)激時(shí)它與BCL2分離開始形成用于自噬的Ⅲ類磷脂酰肌醇3激酶復(fù)合物。本研究表明，通過(guò)線粒體自噬去除受損的線粒體是自噬提供肝臟保護(hù)的重要機(jī)制。

PINK1和PRKN/PARK2在介導(dǎo)缺血性急性肝臟損傷肝臟細(xì)胞線粒體自噬中的作用。HK-2細(xì)胞中PINK1和PRKN的沉默抑制ATP D-R期間的線粒體自噬，但對(duì)一般或非選擇性自噬沒(méi)有顯著影響，表明RNAi介導(dǎo)的PINK1和PRKN敲除不足以抑制一般自噬。這一結(jié)果并不令人意外，因?yàn)榫€粒體自噬是自噬的選擇性形式，需要一種獨(dú)特的啟動(dòng)過(guò)程，即ATP D-R期間在肝臟細(xì)胞中由PINK1-PRKN/PARK2介導(dǎo)。在PINK1-PRKN/PARK2途徑中，普遍認(rèn)為PRKN/PARK2介導(dǎo)的MOM上線粒體蛋白質(zhì)的泛素化對(duì)于自噬誘導(dǎo)至關(guān)重要。Lazarou等最近的報(bào)道認(rèn)為PINK1可獨(dú)立于PARK2直接聚集自噬受體誘導(dǎo)線粒體自噬。相反，Kubli等表示在心肌細(xì)胞中，PARK2聚集到線粒體中用于線粒體蛋白泛素化和線粒體自噬，而與PINK1無(wú)關(guān)。在急性肝臟損傷期間，由于線粒體動(dòng)力學(xué)從融合變?yōu)榱炎?，線粒體在相當(dāng)數(shù)量的肝臟細(xì)胞中變成碎片且線粒體碎裂導(dǎo)致肝臟細(xì)胞死亡。急性肝臟損傷進(jìn)展為慢性病理過(guò)程中，一些肝臟細(xì)胞中持續(xù)存在于破碎的線粒體。

圖6 在肝臟I-R損傷期間， Pink1 和/或 Park2 敲除增加肝臟細(xì)胞凋亡。

除了損害細(xì)胞能量學(xué)之外，受損線粒體可通過(guò)產(chǎn)生過(guò)量ROS來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞毒性。盡管pink1和park2單敲除或雙敲除小鼠在肝臟I-R后具有可比較的ROS水平，但park2-KO和pink1 park2-dKO小鼠肝臟組織比pink1- KO小鼠顯示明顯更多的巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞，表明PARK2可能對(duì)炎癥有某些額外作用。在這方面，脫離自噬降解的線粒體DNA也可以激活炎癥。因此研究PARK2是否參與線粒體DNA清除和釋放的調(diào)節(jié)會(huì)很有意思。

PINK1和PRKN/PARK2可能具有除線粒體自噬外的其他功能。例如，PINK1和PRKN/PARK2調(diào)節(jié)線粒體中的囊泡運(yùn)輸。PINK1還可調(diào)節(jié)復(fù)合物I活性從而參與調(diào)節(jié)線粒體生物能量學(xué)。在先天免疫方面，PRKN/PARK2可促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌病原體的自噬降解。最近發(fā)現(xiàn)PINK1和PRKN/PARK2在內(nèi)毒素和熱應(yīng)激條件下通過(guò)負(fù)調(diào)節(jié)線粒體衍生的囊泡通路來(lái)抑制線粒體抗原呈遞。因此，調(diào)查PINK1和PRKN/PARK2在肝臟疾病如急性肝臟損傷中與線粒體自噬無(wú)關(guān)的功能很有意義。

綜上所述，本研究證實(shí)了缺血性急性肝臟損傷體外和體內(nèi)模型中線粒體自噬激活的實(shí)質(zhì)性證據(jù)。此情況下的線粒體自噬主要由PINK1-PRKN/PARK2途徑介導(dǎo)。通過(guò)清除受損的線粒體，PINK1-PRKN/PARK2介導(dǎo)的線粒體自噬在維持線粒體質(zhì)量中起重要作用，幫助肝臟細(xì)胞存活并從缺血性應(yīng)激中恢復(fù)。此外，及時(shí)清除受損線粒體也能減少ROS的產(chǎn)生和炎癥。