李美艷， 韓新彥， 王菊榮， 呼君瑜， 陳永學(xué)， 張易欣， 宋春麗， 盧 靜， 牛廣旭

(邯鄲市中心醫(yī)院1婦一科， 2麻醉科， 3生殖醫(yī)學(xué)科， 4病理科， 河北 邯鄲 056008)

子宮內(nèi)膜癌(endometrial carcinoma，EC)是最常見的婦科惡性腫瘤之一[1]，血管生成在腫瘤的發(fā)展、凋亡等過程中發(fā)揮著重要作用[2]。血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry，VM)是一種全新腫瘤血管結(jié)構(gòu)，VM被證實(shí)在多種惡性腫瘤中存在[3-4]。肥胖作為子宮內(nèi)膜癌的“三聯(lián)征”之一，與EC發(fā)生密切相關(guān)，瘦素(Leptin)作為重要的脂肪因子扮演著重要的角色[1]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的活化與遷移，是一種重要的促血管生成蛋白[5]。VM、Leptin、VEGF均與EC等腫瘤的侵襲性密切相關(guān)[2,6]。了解三者與EC之間的關(guān)系，有助于更好地了解EC的發(fā)病機(jī)制，也為其治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1臨床資料選取邯鄲市中心醫(yī)院診治患者共345例為研究對(duì)象：經(jīng)病理檢查為EC并進(jìn)行了手術(shù)治療的患者197例(EC組)，不典型增生患者85例(不典型增生組)，正常子宮內(nèi)膜患者63例(正常子宮內(nèi)膜組)。EC患者年齡24～72歲，平均年齡(50.19±0.68)歲?！?0歲104例，<50歲93例。根據(jù)國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO 2009)手術(shù)-病理分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ～Ⅱ期170例，Ⅲ～Ⅳ期27例；組織學(xué)分化：高、中分化144例，低分化53例；肌層浸潤(rùn)深度：≥1/2肌層51例，<1/2肌層146例；組織學(xué)類型：Ⅰ型155例，Ⅱ型42例。術(shù)后證實(shí)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移25例，無轉(zhuǎn)移172例。實(shí)驗(yàn)標(biāo)本均來自于診刮及手術(shù)切除子宮的內(nèi)膜標(biāo)本，排除有心、腦、腎重要器官功能障礙、凝血系統(tǒng)障礙、出血疾病者，就診前均未行放射、化療治療，EC患者均為初次手術(shù)且腫瘤均為原發(fā)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法采用CD34-PAS雙重染色法，檢測(cè)各內(nèi)膜組織中VM的表達(dá)；免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)Leptin和VEGF蛋白的表達(dá)情況。PAS染色試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，大鼠抗小鼠CD34抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，兔抗體Leptin多克隆抗體購(gòu)自北京中山生物技術(shù)有限公司，鼠抗人VEGF單克隆抗體、免疫組織化學(xué)SP試劑盒、PBS緩沖液、DAB試劑盒均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)公司，各實(shí)驗(yàn)步驟均嚴(yán)格按相應(yīng)試劑的說明書進(jìn)行操作。CD34-PAS雙染色步驟參照文獻(xiàn)[7]，免疫組化SP法步驟參照文獻(xiàn)[8]。

1.3結(jié)果判定存在VM 結(jié)構(gòu)的判定標(biāo)準(zhǔn)：由CD34染色結(jié)果陰性的腫瘤細(xì)胞構(gòu)成管腔樣結(jié)構(gòu)，PAS陽(yáng)性物質(zhì)(紫紅色)襯附其周圍，且未見CD34陽(yáng)性的內(nèi)皮細(xì)胞，部分管腔內(nèi)可見紅細(xì)胞，即VM結(jié)構(gòu)陽(yáng)性標(biāo)志為CD34-/PAS+[9]。免疫組化SP法判定評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：Leptin蛋白陽(yáng)性細(xì)胞染色為細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色或黃色顆粒；VEGF蛋白陽(yáng)性染色大多數(shù)定位于癌細(xì)胞胞漿或胞膜中，陽(yáng)性著色呈淡黃色至棕黃色顆粒。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用統(tǒng)計(jì)軟件IBM SPSS StatisticsVersion 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，計(jì)數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，用Pearson法和連續(xù)校正公式來計(jì)算。采用列聯(lián)系數(shù)進(jìn)行VM、Leptin、VEGF三者之間的相關(guān)性分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1免疫組化SP法染色結(jié)果CD34-PAS雙重染色：VM陽(yáng)性78例，陰性119例；Leptin陽(yáng)性155例，陰性42例；VEGF陽(yáng)性134例，陰性63例(圖1～3)。

2.23組VM、Leptin、VEGF表達(dá)情況比較EC組VM結(jié)構(gòu)和Leptin、VEGF蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率較不典型增生組、正常子宮內(nèi)膜組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=60.668，P<0.05；χ2=105.873，P<0.05；χ2=98.976，P<0.05)，具體結(jié)果見表1。

圖1 VM在子宮內(nèi)膜癌中CD34-PAS雙重染色(×400)

表1 3組VM、Leptin、VEGF表達(dá)情況比較/例

注：*表示χ2=60.668，P=0.000;#表示χ2=105.873，P=0.000;△表示χ2=98.976，P=0.000。

2.3VM、Leptin、VEGF與EC臨床病理特征的關(guān)系VM結(jié)構(gòu)和Leptin、VEGF蛋白表達(dá)均與手術(shù)-病理分期、組織學(xué)分化有關(guān)(P均<0.05)，另外，VM和Leptin表達(dá)還與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05)，而在年齡、肌層浸潤(rùn)深度、組織學(xué)類型中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 VM、Leptin、VEGF與EC臨床病理特征的關(guān)系

注：EC為子宮內(nèi)膜癌；VM為血管生成擬態(tài)；Leptin為瘦素；VEGF為血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子。

2.4VM、Leptin和VEGF在EC中的相關(guān)關(guān)系VM、Leptin、VEGF蛋白三者在EC中表達(dá)情況進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示三者均呈正相關(guān)關(guān)系，表明三者在EC的發(fā)生、發(fā)展中具有明顯的正向協(xié)同效應(yīng)(r均為正數(shù)；P均<0.05)，結(jié)果見表3～5。

表3 VM表達(dá)和VEGF蛋白的關(guān)系

注：列聯(lián)系數(shù)：r=0.286,P=0.001。

表4 Leptin和VEGF蛋白表達(dá)的關(guān)系

注：列聯(lián)系數(shù)：r=0.649,P=0.000。

注：列聯(lián)系數(shù)：r=0.435,P=0.000。

3 討論

3.1VM結(jié)構(gòu)與腫瘤經(jīng)典觀點(diǎn)認(rèn)為只有內(nèi)皮細(xì)胞才能形成血管，但VM作為除血管外供應(yīng)腫瘤生長(zhǎng)的重要結(jié)構(gòu)[10]，在多種腫瘤的進(jìn)展、轉(zhuǎn)移中均發(fā)揮著重要作用[11]。VM不依賴于血管內(nèi)皮細(xì)胞，這一腫瘤內(nèi)管狀網(wǎng)絡(luò)模式，可能為抗腫瘤血管治療提供新的思路[12]。

本研究顯示，197例EC組織中，VM結(jié)構(gòu)陽(yáng)性(VM+)78例(39.59%)，VM陰性(VM-)119例(60.41%)，EC組織中有78例存在符合標(biāo)準(zhǔn)的通道結(jié)構(gòu)，而在不典型增生子宮內(nèi)膜和正常子宮內(nèi)膜中分別僅為4.71%和1.59%，說明EC中存在VM現(xiàn)象，EC組VM存在的概率顯著增高，在EC組較其他組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。EC組織中VM的形成與患者的年齡、肌層浸潤(rùn)深度及組織學(xué)類型均無關(guān)，而與EC手術(shù)-病理分期、組織學(xué)分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均密切相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示，具有VM的EC惡性程度高易發(fā)生轉(zhuǎn)移，隨著較晚的手術(shù)-病理分期、較差的組織學(xué)分化和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，VM存在的概率顯著增高(P<0.05)。組織學(xué)分化程度越低及惡性程度越高的EC形成VM的能力越強(qiáng)，越易發(fā)生轉(zhuǎn)移，惡性度更高，與陳純等[11]的研究結(jié)果相一致，提示VM可能會(huì)成為診斷EC的重要指標(biāo)之一。

3.2Leptin蛋白與腫瘤Leptin是一種分泌型蛋白質(zhì)，是第1個(gè)被發(fā)現(xiàn)的脂肪細(xì)胞分泌的激素，已證實(shí)在促進(jìn)細(xì)胞增殖和血管生成等方面具有重要作用，與多種腫瘤的發(fā)生相關(guān)[13]。

本研究染色結(jié)果顯示，197例EC組織中，Leptin陽(yáng)性155例(78.68%)，Leptin陰性42例(21.32%)，在不典型增生子宮內(nèi)膜和正常子宮內(nèi)膜中分別僅為32.94%和9.52%，說明EC中Leptin蛋白表達(dá)陽(yáng)性的比率顯著增高，提示高Leptin表達(dá)水平可能促進(jìn)EC的發(fā)生、發(fā)展，Leptin可能促進(jìn)腫瘤增殖和抑制細(xì)胞凋亡，Leptin的檢測(cè)可能成為臨床預(yù)測(cè)EC的一個(gè)指標(biāo)，有可能作為區(qū)分良惡性子宮內(nèi)膜組織的標(biāo)志。EC組織中Leptin的高表達(dá)與EC患者的手術(shù)-病理分期、組織學(xué)分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均密切相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示Leptin陽(yáng)性表達(dá)與EC病情進(jìn)展有緊密聯(lián)系，這與以往研究結(jié)果相一致，提示Leptin可能參與了EC的侵襲和遷移過程。

3.3VEGF蛋白與腫瘤本研究中VEGF蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果顯示，197例EC患者中VEGF表達(dá)陽(yáng)性(VEGF+)134例，陰性(VEGF-)63例，在不典型增生子宮內(nèi)膜和正常子宮內(nèi)膜中分別僅為21.18%和4.76%，VEGF在EC組較其他組表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示VEGF的高表達(dá)和EC的形成發(fā)展過程密切相關(guān)。VEGF可能是通過促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的分化，調(diào)控血管的生成，從而促進(jìn)腫瘤形成與發(fā)展[6]，預(yù)示EC組織中VEGF的高侵襲性及易轉(zhuǎn)移性，與王淑貞等[2]的研究結(jié)果一致。EC組織中VEGF的高表達(dá)與EC患者的手術(shù)-病理分期、組織學(xué)分化程度均密切相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明VEGF陽(yáng)性表達(dá)會(huì)隨著EC的臨床分期增加而增高，會(huì)隨腫瘤惡性程度的增高而增強(qiáng)，VEGF表達(dá)與EC病情進(jìn)展有著緊密的聯(lián)系，可能成為判斷EC預(yù)后的指標(biāo)，這與王淑貞等[2]的研究結(jié)果大體一致，但組織學(xué)分化因素不太一致，這可能由于本研究病例數(shù)相對(duì)較少，有必要在以后的診斷治療過程中收集更多的病例，展開更深入的研究。

3.4VM、Leptin和VEGF蛋白之間的相關(guān)關(guān)系劉林枝等[1]報(bào)道，Leptin參與EC的細(xì)胞增殖、血管生成、凋亡抑制等過程，Leptin發(fā)揮類似于生長(zhǎng)因子的作用。范曉琳等[13]也指出，Leptin是血管生成的刺激因子，可通過促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的分裂增殖促進(jìn)新生血管形成。國(guó)外，Misztal-Dethloff等[14]的研究表明，Leptin通過VEGF等內(nèi)源性血管內(nèi)皮刺激因子促進(jìn)血管生成。本結(jié)果顯示：VEGF陽(yáng)性表達(dá)情況與VM結(jié)構(gòu)陽(yáng)性呈正相關(guān)，存在VM的EC中VEGF表達(dá)水平更高。Leptin與VEGF蛋白陽(yáng)性表達(dá)呈正相關(guān)，VM與Leptin呈正相關(guān)，VM結(jié)構(gòu)陽(yáng)性、Leptin蛋白高表達(dá)、VEGF蛋白高表達(dá)的病例具有更高的臨床分期和更差的組織學(xué)分化，也更易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，提示存在VM結(jié)構(gòu)的EC侵襲性和轉(zhuǎn)移能力更強(qiáng)，Leptin蛋白及VEGF蛋白能較好地誘導(dǎo)血管新生，與EC病情進(jìn)展聯(lián)系緊密，可能成為判斷EC病情的指標(biāo)之一。

綜上所述，VM、Leptin和VEGF蛋白在EC中的表達(dá)與正常組和不典型增生組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，三者表達(dá)之間正相關(guān)，在EC中的表達(dá)具有明顯的正向協(xié)同效應(yīng)。提示VM結(jié)構(gòu)、Leptin蛋白和VEGF蛋白可能共同參與了EC腫瘤增殖，在EC的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移等過程中共同起著重要作用，聯(lián)合檢測(cè)三者可能更有效地鑒別子宮內(nèi)膜良惡性腫瘤，可能作為EC臨床診斷和預(yù)測(cè)的參考指標(biāo)之一。