鄭瑞芳， 曾 誠(chéng)， 都研文， 姜 雯， 江 靜， 邢建國(guó)

(1新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院， 烏魯木齊 830011； 2新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所， 烏魯木齊 830004； 3新疆醫(yī)科大學(xué)第六附屬醫(yī)院藥劑科， 烏魯木齊 830002； 4石河子大學(xué)藥學(xué)院， 新疆 石河子 832000)

缺血性腦卒中是當(dāng)今世界最具神經(jīng)系統(tǒng)破壞性的疾病之一，腦卒中目前為止還沒(méi)有有效的治療藥物，其導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)損傷的病理機(jī)制尚不明確，尋找有效的生物靶點(diǎn)，研發(fā)理想的治療藥物尤為迫切[1-3]。香青蘭為唇形科青蘭屬植物香青蘭(DracocephalumMoldavicaL.)的干燥地上部分，分布于我國(guó)東北、西北和華北等地區(qū)，在新疆資源特別豐富,已從香青蘭中分離得到黃酮類、三萜類、甾體類、苯丙素類、環(huán)烯醚萜類和多糖等化學(xué)成分，具有抗心肌缺血、益心護(hù)腦、抗氧化、抗炎和降壓等功效，臨床主要用于治療心臟病、 高血壓、寒性神經(jīng)性頭痛、寒性感冒、氣管炎等[4]。本課題組前期研究表明黃酮類化合物是香青蘭有效部位，對(duì)腦卒中有較好的效果[5]。本研究采用CCK-8試劑盒法、活性氧(ROS)檢測(cè)試劑盒法和Western blot法，探究香青蘭總黃酮對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)U87細(xì)胞損傷的保護(hù)作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1儀器DV215CD型電子分析天平( 瑞士梅特勒公司)，BDS-FL型熒光倒置顯微鏡(奧特光學(xué)儀器)， HERA cell-150i型 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)，SW-CJ-1B型超凈工作臺(tái)(上海諾萱科學(xué)儀器有限公司)，PK-S22型電熱恒溫水浴鍋(上海精宏儀器有限公司)。

1.2試藥香青蘭總黃酮(實(shí)驗(yàn)室自制，20170715)；U87細(xì)胞(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物技術(shù)研究所惠贈(zèng)，批號(hào)20170128)；gibco胎牛血清(上海江林生物科技有限公司，批號(hào)1932595)； 0.25%胰酶(美國(guó)Thermo公司，批號(hào)J180003)；DMEM高糖培養(yǎng)基(美國(guó)Thermo公司，批號(hào)AD17497265)；CCK-8檢測(cè)試劑盒(中國(guó)博士德生物工程有限公司，批號(hào)13C21C60)；P-p44/p42MAPK抗體(美國(guó)CST生物公司，批號(hào)4370S)；p44/p42MAPK抗體(美國(guó)CST生物公司，批號(hào)9107S)；GAPDH蛋白[艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司，批號(hào) 18AFO0403]。

1.3藥材香青蘭藥材2016年7月采集于新疆維吾爾自治區(qū)吉木薩爾縣，經(jīng)新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所民族藥研究室何江副研究員鑒定為為唇形科青蘭屬植物香青蘭(DracocephalumMoldavicaL.)的干燥地上部分。

1.4香青蘭總黃酮的制備取香青蘭藥材粗粉，加入20倍量的40%乙醇回流提取3 h，濾過(guò)，取上清，減壓濃縮至0.125 g/mL。按大孔吸附樹(shù)脂柱床體積∶藥液比例為2∶9，以流速1.5 BV/h通過(guò)HPD100型大孔吸附樹(shù)脂柱，靜置吸附6 h后，用4 BV水以流速3.0 BV/h洗脫，棄去洗脫液，再用6 BV 70%乙醇溶液以流速2.0 BV/h洗脫，收集洗脫液，將所收集的70%乙醇洗脫液, 減壓濃縮至相對(duì)密度為1.22～1.25(60℃)的清膏，噴霧干燥，即得。

1.5細(xì)胞培養(yǎng)U87細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖完全培養(yǎng)基于在37℃、5%CO2的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到85%～90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化液消化細(xì)胞，以1∶2的比例進(jìn)行傳代，每隔2～3天傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于培養(yǎng)板中進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.6模型的建立與分組

1.6.1 H2O2損傷模型的建立 選用U87細(xì)胞來(lái)模擬缺血性腦卒中神經(jīng)細(xì)胞損傷，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的U87細(xì)胞，按實(shí)驗(yàn)所需種于不同的培養(yǎng)板中待完全貼壁后，棄去原培養(yǎng)基，加入H2O2處理20 min模擬氧化應(yīng)激，隨后用冷的PBS洗2遍，加入含10%胎牛血清的DMEM高糖完全培養(yǎng)基，即得H2O2損傷模型細(xì)胞。

1.6.2 細(xì)胞分組 對(duì)照組U87細(xì)胞不給任何藥物預(yù)處理，同時(shí)也不經(jīng)歷氧化應(yīng)激過(guò)程；模型組U87細(xì)胞不給任何藥物預(yù)處理，只進(jìn)行氧化應(yīng)激處理；實(shí)驗(yàn)組U87細(xì)胞給予不同濃度香青蘭總黃酮預(yù)處理2 h，再進(jìn)行氧化應(yīng)激處理。

1.7香青蘭總黃酮對(duì)U87細(xì)胞毒性影響將處于取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U87細(xì)胞1×105個(gè)接種于96孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞完全貼壁后，分別更換含不同濃度香青蘭總黃酮(200.00、100.00、50.00、25.00、12.50、6.25、3.13、1.56 μg/mL)的DMEM高糖完全培養(yǎng)基100 μL。對(duì)照組更換正常DMEM高糖完全培養(yǎng)基，48 h后用CCK-8試劑盒檢測(cè)OD值計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.8不同H2O2濃度對(duì)U87細(xì)胞存活率的影響將處于取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U87細(xì)胞1×105個(gè)接種于96孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞完全貼壁后，分為5.00、2.50、1.25、0.63、0.31、0.16 mmol/L 濃度H2O2組，對(duì)照組更換正常DMEM高糖完全培養(yǎng)基，(均含1%DMSO)，待造模結(jié)束后，用CCK-8試劑盒檢測(cè)OD值計(jì)算U87細(xì)胞存活率。

1.9不同預(yù)給藥時(shí)間對(duì)U87細(xì)胞存活率的影響將處于取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U87細(xì)胞1×105個(gè)接種于96孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞完全貼壁后用100 μg/mL 香青蘭總黃酮的DMEM高糖培養(yǎng)基100 μL，分別預(yù)處理U87細(xì)胞48、36、24、12、10、8、6、4、3、2.5、2、1.5、1 h。模型組和對(duì)照組加入等體積的不含藥的DMEM高糖完全培養(yǎng)基(均含1%DMSO)，除正常組外其他組均給予氧化應(yīng)激處理，用CCK-8試劑盒檢測(cè)OD值計(jì)算U87細(xì)胞存活率。

1.10不同預(yù)給藥濃度對(duì)U87細(xì)胞存活率的影響將處于取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U87細(xì)胞1×105個(gè)接種于96孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞完全貼壁后分別用濃度200.00、100.00、50.00、25.00、12.50、6.25、3.13、1.56 μg/mL的香青蘭總黃酮DMEM高糖培養(yǎng)基100 μL，預(yù)處理U87細(xì)胞2 h。模型組和正常培養(yǎng)基組加入等體積的不含藥的DMEM高糖完全培養(yǎng)基(均含1%DMSO)，除正常組外其他組均給予氧化應(yīng)激處理，用CCK-8試劑盒檢測(cè)OD值計(jì)算U87細(xì)胞存活率。

1.11香青蘭總黃酮對(duì)H2O2刺激U87細(xì)胞引起的ROS過(guò)量生成的影響將處于取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U87細(xì)胞1×105個(gè)接種于6孔板中，待融合度達(dá)到80%以上，用含100、50、25、5 μg/mL濃度香青蘭總黃酮的DMEM高糖完全培養(yǎng)基處理U87細(xì)胞2 h，隨后進(jìn)行氧化應(yīng)激造模，造模結(jié)束后，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗2遍，分別加入10 μmol/L的DCFH-DA工作液1 mL于6孔板中，37℃下避光孵育30 min，棄去培養(yǎng)基，用不含胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基清洗3遍，熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，檢測(cè)光波長(zhǎng)525 nm；以只加DCFH-DA探針的細(xì)胞為陰性對(duì)照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，用DCF的平均熒光反映細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平。

1.12Westernblot檢測(cè)P-p44/p42MAPK、p44/p42MAPK蛋白水平將對(duì)照組、模型組、實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞按“1.6.1”項(xiàng)下方法處理，加入含有苯甲基酰氟(Phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF) 的裂解液，放在冰上裂解反應(yīng)30 min，在-4℃以12 000 r/min離心 20 min，吸取蛋白上清液至EP管中。二喹啉甲酸 ( Bicinchoninic acid，BCA) 蛋白定量試劑盒檢測(cè)提取的蛋白濃度。將蛋白樣品與 5×loading buffer( 4∶1) 充分混合后，放在100℃煮沸5 min。蛋白凝膠上樣孔中每孔加入15 μL的變性蛋白樣品，0.6A/4塊膠電泳至結(jié)束，凝膠蛋白在4℃、100V電壓下轉(zhuǎn)膜30min。用7%脫脂奶粉封閉1h后分別孵育P-p44/p42MAPK、p44/p42MAPK一抗(稀釋1 000倍，-4℃孵育過(guò)夜)，用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記Ⅱ抗1 h，顯影，曝光。

2 結(jié)果

2.1香青蘭總黃酮對(duì)U87細(xì)胞毒性分別用200.00、100.00、50.00、25.00、12.50、6.25、3.13、1.56、0.78 μg/mL 9個(gè)濃度刺激U87細(xì)胞48 h，結(jié)果9個(gè)濃度的香青蘭總黃酮溶液對(duì)U87細(xì)胞存活率均沒(méi)有影響，表明有效濃度的香青蘭總黃酮對(duì)U87細(xì)胞沒(méi)有毒性，見(jiàn)圖1。

圖1 香青蘭總黃酮對(duì)U87細(xì)胞的毒性

2.2不同H2O2濃度對(duì)U87細(xì)胞存活率的影響分別用5.00、2.50、1.25、0.63、0.31、0.16 mmol/L 6個(gè)濃度的H2O2溶液損傷U87細(xì)胞20 min，當(dāng)H2O2濃度大于0.31 mmol/L時(shí)，可引起U87細(xì)胞損傷，因此確定H2O2損傷濃度為0.31 mmol/L，見(jiàn)圖2。

2.3不同預(yù)給藥時(shí)間對(duì)U87細(xì)胞存活率的影響用100 μg/mL香青蘭總黃酮溶液分別預(yù)給藥48、36、24、12、10、8、6、4、2、1 h，用濃度為0.31 mmol/L H2O2損傷20 min造模，結(jié)果香青蘭總黃酮預(yù)給藥時(shí)間為2 h時(shí)，U87細(xì)胞存活率最高，因此香青蘭總黃酮預(yù)給藥時(shí)間定為2 h,見(jiàn)圖3。

圖2 不同H2O2濃度對(duì)U87細(xì)胞存活率的影響

圖3不同預(yù)給藥時(shí)間對(duì)U87細(xì)胞存活率的影響

2.4不同預(yù)給藥濃度對(duì)U87細(xì)胞存活率的影響分別用200.00、100.00、50.00、25.00、12.50、6.25、3.13、1.56 μg/mL 8個(gè)濃度的香青蘭總黃酮溶液預(yù)給藥2 h，用濃度為0.31 mmol/L H2O2損傷20 min造模，結(jié)果濃度為12.5 mmol/L 的香青蘭總黃酮溶液U87細(xì)胞存活率最高，見(jiàn)圖4。

圖4 不同預(yù)給藥濃度對(duì)U87細(xì)胞存活率的影響

2.5不同濃度藥物預(yù)處理對(duì)H2O2刺激U87細(xì)胞引起的ROS過(guò)量生成的影響與對(duì)照組比較，模型組ROS水平增高，不同濃度香青蘭總黃酮溶液可抑制ROS的產(chǎn)生,見(jiàn)圖5。

2.6Westernblot檢測(cè)P-p44/p42MAPK、p44/p42MAPK蛋白水平與對(duì)照組比較，模型組U87細(xì)胞P-p44/p42MAPK表達(dá)受到抑制，實(shí)驗(yàn)組不同濃度的香青蘭總黃酮均可升高P-p44/p42MAPK蛋白的表達(dá),且呈現(xiàn)劑量依賴性,見(jiàn)圖6。

圖5 不同藥物預(yù)處理對(duì)H2O2刺激U87細(xì)胞引起的ROS過(guò)量生成的影響

3 討論

氧化應(yīng)激腦缺血/再灌注(I/R)損傷過(guò)程中最常見(jiàn)的損傷，也是導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞損傷和神經(jīng)退行性疾病如動(dòng)脈粥樣硬化、阿爾茲海默癥、腦卒中等的主要原因，保護(hù)星形膠質(zhì)細(xì)胞在氧化應(yīng)激條件下的生存活力是減少神經(jīng)元死亡，減少梗死面積的關(guān)鍵。黃酮類化合物已被提出在癌癥、心血管疾病和神經(jīng)退行性疾病等多種疾病中發(fā)揮作用[4-6]。黃酮類化合物在血腦屏障(BBB)中有很好的報(bào)道，并已在大腦中檢測(cè)到，如海馬、大腦皮層、小腦和紋狀體[7-10]，它們對(duì)學(xué)習(xí)和記憶的形成很重要，與此同時(shí)也被衰老和神經(jīng)退化所損害。越來(lái)越多的人觀察到，總黃酮通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)揮保護(hù)細(xì)胞的作用，如原激活蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路。激酶和磷酸酶之間的平衡和高度動(dòng)態(tài)相互作用對(duì)于控制細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)是至關(guān)重要的，因此蛋白激酶和磷酸酶的異常調(diào)節(jié)可能在諸如糖尿病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病等疾病中起作用[11]。

本課題組首次發(fā)現(xiàn)香青蘭總黃酮對(duì)神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用，H2O2對(duì)U87細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷呈濃度依賴式，且損傷時(shí)間對(duì)其損傷程度影響較大，香青蘭總黃酮預(yù)處理可減弱H2O2誘導(dǎo)的U87細(xì)胞的細(xì)胞損傷，減少ROS的產(chǎn)生，抑制細(xì)胞凋亡起到抗氧化作用。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1和2(ERK1/2)被稱為經(jīng)典MAP激酶，其響應(yīng)于應(yīng)激信號(hào)而被激活。既往研究發(fā)現(xiàn)腦卒中患者腦內(nèi)磷酸化ERK1/2/MAPK水平與氧化應(yīng)激相關(guān)，氧化應(yīng)激過(guò)程中P-ERK1/2被激活，通過(guò)阻斷細(xì)胞凋亡來(lái)對(duì)抗氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞損傷[12-17]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，香青蘭總黃酮通過(guò)激活P-ERK1/2來(lái)保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞免受氧化應(yīng)激。在氧化應(yīng)激或缺氧過(guò)程中，絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)通路被激活，對(duì)細(xì)胞外刺激起反應(yīng)，并調(diào)節(jié)各種細(xì)胞活性，如分化、增殖、存活和凋亡。與模型組相比香青蘭總黃酮干預(yù)組的細(xì)胞ROS含量降低，P-ERK1/2蛋白含量均明顯高于模型組，且呈現(xiàn)劑量依賴，表明香青蘭總黃酮通過(guò)激活P-ERK1/2通路，抑制ROS過(guò)量產(chǎn)生，從而起到拮抗H2O2對(duì)U87細(xì)胞增殖的抑制作用。這種神經(jīng)保護(hù)特性表明，香青蘭總黃酮可以作為神經(jīng)退行性疾病的潛在治療劑，研究結(jié)果可為香青蘭總黃酮治療神經(jīng)退行性疾病的藥物開(kāi)發(fā)提供參考。