王培成， 李曉榮， 劉新義， 王吉生

(1威海市市立醫(yī)院耳鼻喉頭頸外科； 2威海衛(wèi)人民醫(yī)院婦產(chǎn)科, 山東 威海 264200)

甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)中常見的惡性腫瘤，發(fā)病率呈現(xiàn)出明顯增高的趨勢(shì)[1]，乳頭狀癌是其常見的病理類型。自噬是細(xì)胞利用溶酶體降解自身受損的細(xì)胞器和大分子物質(zhì)的過程，是真核細(xì)胞特有的生命現(xiàn)象[2]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，自噬與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，微管相關(guān)蛋白/轉(zhuǎn)鏈3(microtuble-associated protein/hight chain 3, LC3)作為一種自噬相關(guān)基因，已被作為是自噬表達(dá)水平的特異性方法之一[3]，目前LC3已作為自噬的標(biāo)記性分子用于檢測(cè)自噬。Beclin-1基因是哺乳動(dòng)物參與自噬的特異性基因，作為腫瘤抑制基因，通過調(diào)控細(xì)胞自噬，從而達(dá)到維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的作用[4]。本研究從自噬的角度出發(fā)，闡明LC3和Beclin-1在甲狀腺癌中的表達(dá)規(guī)律，對(duì)研究甲狀腺癌的發(fā)生機(jī)制及臨床干預(yù)具有重要意義。

1 資料與方法

1.1臨床資料收集2013-2016年威海市市立醫(yī)院甲狀腺外科手術(shù)切除的甲狀腺癌63例標(biāo)本，其中男性17例，女性46例，年齡17～67歲，平均63.4歲。所選病例術(shù)前未經(jīng)任何輔助治療，臨床病理資料完整。病理資料經(jīng)兩位病理專家病理學(xué)檢查確診為甲狀腺癌。以距腫瘤邊緣5 cm以上的組織定義為配對(duì)癌旁組織。收集同期住院的甲狀腺腺瘤(42例)和結(jié)節(jié)性甲狀腺腫病例(31例)，均經(jīng)病理學(xué)檢查確診。所有標(biāo)本的使用均經(jīng)我院倫理委員會(huì)同意，取得患者或家屬的知情同意。標(biāo)本經(jīng)10%中性福爾馬林固定、石蠟包埋、切片后行免疫組化檢測(cè)。每例標(biāo)本切片厚約4 μm。

1.2主要儀器與試劑石蠟切片機(jī)、顯微鏡(日本OLYMPUS)、電恒溫箱、微波爐。蘇木精，免抗人Beclin-1和LC3多克隆抗體(Abcam公司)，免疫組織化學(xué)SP試劑盒和DAB試劑盒購自上海生物工程有限公司。

1.3方法采用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)上述標(biāo)本中Beclin-1和LC3抗體的表達(dá)情況，具體免疫組化操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.4結(jié)果判定Beclin-1和LC3蛋白陽性染色主要定位于細(xì)胞質(zhì)，由2位病理醫(yī)師對(duì)切片進(jìn)行閱片，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野(×400)，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，以胞質(zhì)或胞核染為淡黃色至棕褐色為陽性標(biāo)準(zhǔn)。陽性細(xì)胞表達(dá)率：<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。以0～1分為陰性，2分及以上為陽性。

2 結(jié)果

2.1Beclin-1和LC3在甲狀腺癌、腺瘤、甲狀腺腫及癌旁正常組織中的表達(dá)情況Beclin-1和LC3蛋白陽性表達(dá)主要定位于胞質(zhì)，偶見細(xì)胞核著色，呈明顯的淡黃色或棕褐色顆粒。Beclin-1和LC3蛋白在甲狀腺癌及癌旁正常組織中的表達(dá)見圖1～圖4。

各組織Beclin-1的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。甲狀腺癌中Beclin-1蛋白的表達(dá)率為39.68%(25/63)，甲狀腺腺瘤、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫和癌旁正常組織中Beclin-1的陽性表達(dá)率分別為69.05%(29/42)、83.87%(26/31)和85.71%(54/63)。甲狀腺癌中Beclin-1表達(dá)的陽性率明顯低于甲狀腺腺瘤、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫和癌旁正常組織(P<0.05)。LC3蛋白在甲狀腺癌的陽性表達(dá)率為74.6%(47/63)，在甲狀腺腺瘤、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫和癌旁正常組織中的陽性表達(dá)率分別為40.48%(17/42)、38.72%(12/31)和50.94%(27/63)。在甲狀腺癌中LC3表達(dá)低于以上正常的3種組織。4者比較Beclin-1的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

圖1 Beclin-1在癌旁正常甲狀腺中的陽性表達(dá) 圖2 LC3在癌旁正常甲狀腺中的陽性表達(dá) 圖3 Beclin-1在甲狀腺癌中陰性的表達(dá) 圖4 LC3在甲狀腺癌中的陰性表達(dá)

表1 Beclin-1、LC3在甲狀腺癌、腺瘤、甲狀腺腫及癌旁正常組織中的表達(dá)/例(%)

2.2LC3和Beclin-1的表達(dá)與甲狀腺癌臨床病理特征之間的關(guān)系LC3蛋白表達(dá)與甲狀腺癌患者性別、年齡、腫瘤大小、病理類型及有無頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移各組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Beclin-1蛋白表達(dá)與其性別、年齡及腫瘤大小各組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Beclin-1蛋白的表達(dá)與頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的甲狀腺癌Beclin-1蛋白陽性表達(dá)率明顯低于未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者(χ2=8.433，P=0.000)，見表2。

表2 Beclin-1和LC3的表達(dá)與甲狀腺癌臨床病理特征之間的關(guān)系/例

2.3LC3與Beclin-1在甲狀腺癌中的表達(dá)的相關(guān)性經(jīng)Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)分析，在甲狀腺癌中LC3與Beclin蛋白成正相關(guān)(r=0.272，P=0.031)，見表3。

表3 Beclin-1和LC3在甲狀腺癌表達(dá)的相關(guān)性分析/例

3 討論

自噬與腫瘤關(guān)系的研究已成為研究熱點(diǎn)。自噬是細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)代謝的重要途徑，是單細(xì)胞生物、植物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中廣泛存在的降解/再循環(huán)系統(tǒng)的重要組成部分，是一種高度保守的自我破壞性過程，可以表現(xiàn)為分解功能障礙或不必要的細(xì)胞成分。研究發(fā)現(xiàn)，抑癌基因?qū)ψ允善鸫龠M(jìn)作用，可誘導(dǎo)自噬，而癌基因?qū)ψ允僧a(chǎn)生抑制作用[4]。提示自噬可以抑制腫瘤的生長，而抑制自噬可促進(jìn)腫瘤生長。

Beclin-1基因首先被Levine等發(fā)現(xiàn)，位于人類染色體17 q21，是酵母Atg6/Vps30的同源物，在自噬和液泡蛋白分選中發(fā)揮作用[5]。Beclin-1在人類癌癥發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用，但其在不同癌癥中的表達(dá)和功能，即使在同一癌癥的不同階段也不一致。例如，相關(guān)研究表明，Beclin-1的高表達(dá)與非霍奇金淋巴瘤、唾液腺癌和胃癌患者的總體生存率高有關(guān)，Beclin-1陽性患者的子宮內(nèi)膜癌生存率明顯優(yōu)于Beclin-1陰性者，推測(cè)Beclin-1可作為判斷外陰鱗狀細(xì)胞癌預(yù)后的生物標(biāo)志物[6]。Zhao等[7]在手術(shù)的結(jié)腸癌組織中檢測(cè)Beclin-1在結(jié)腸癌標(biāo)本中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其在轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌中低表達(dá)。

本研究采用免疫組化的方法研究自噬相關(guān)基因Beclin-1在甲狀腺癌及癌旁組織中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)其蛋白在甲狀腺癌組織中的表達(dá)染色普遍呈陰性，而在甲狀腺癌旁組織及中，染色呈明顯棕黃色。Beclin-1蛋白在癌旁組織、甲狀腺腺瘤和結(jié)節(jié)性甲狀腺腫中的陽性表達(dá)率高于甲狀腺癌組織，經(jīng)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Beclin-1蛋白在甲狀腺癌中表達(dá)下降，提示其可降低細(xì)胞的自噬反應(yīng)，不能對(duì)自噬腫瘤細(xì)胞的死亡起促進(jìn)作用，可促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。另外，進(jìn)一步研究Beclin-1的表達(dá)與甲狀腺癌的臨床病理特征發(fā)現(xiàn)其與頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，發(fā)生頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的甲狀腺癌患者其表達(dá)陽性率明顯低于未發(fā)生經(jīng)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者。由此可推測(cè)Beclin-1在甲狀腺癌轉(zhuǎn)移過程中起抑制作用。本研究并未發(fā)現(xiàn)Beclin-1與甲狀腺癌的臨床分期有關(guān)，是否與甲狀腺癌的預(yù)后有關(guān)，還需要隨訪資料的支持，后期研究可繼續(xù)探討其表達(dá)與甲狀腺癌患者預(yù)后的關(guān)系。

微管相關(guān)蛋白1A/1B輕鏈3(LC3)家族包括3種同種型(LC3A，LC3B和LC3C。LC3的表達(dá)強(qiáng)度與自噬活性密切相關(guān)，現(xiàn)已作為自噬體的特異性標(biāo)記蛋白[8]。眭怡群等[9]研究顯示，LC在大腸癌中的陽性率高于大腸腺瘤和正常大腸黏膜(P<0.05)，且與大腸癌的組織學(xué)分化程度有關(guān)，提示自噬相關(guān)基因LC3在大腸癌的發(fā)生、發(fā)展中起協(xié)調(diào)作用。本研究與其結(jié)果相反，LC在甲狀腺癌中的陽性表達(dá)低于其它3種甲狀腺良性疾病、癌旁組織，可能與組織類型不同有關(guān)。陳小林等[10]通過免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)到LC在甲狀腺癌組織中的含量最低，并且顯著低于癌旁甲狀腺組織，在發(fā)生轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)組織中LC3含量低于正常淋巴結(jié)組織，本研究結(jié)果顯示，LC與甲狀腺各病理特征中的關(guān)系中，與其頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)，后續(xù)應(yīng)擴(kuò)大樣本進(jìn)行進(jìn)一步的研究。LC3在甲狀腺癌中的表達(dá)下調(diào)，與盧秀波等[11]研究結(jié)果相類似，提示自噬活性的下調(diào)可能與甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展有一定關(guān)系。

惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展受到多種基因，多種調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控，在本研究中經(jīng)Spearman相關(guān)檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Beclin-1蛋白與LC3蛋白在甲狀腺癌中的陽性表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.272，P<0.05)，提示自噬的兩種蛋白在調(diào)控甲狀腺癌的發(fā)生、發(fā)展中關(guān)系密切，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起作用。

綜上所述，基于本研究對(duì)Beclin-1和LC3在甲狀腺癌中低表達(dá)的發(fā)現(xiàn)，Beclin-1、LC3可為甲狀腺癌的早期診斷和治療提供新的靶點(diǎn)。