和義敏 章宏峰 李 芃 梁小芳 姜小麗 高 英

脂溢性角化病(Seborrheic Keratosis, SK)、日光性角化病(Actinic Keratosis, AK)及基底細胞癌(Basal Cell Carcinoma, BCC)是與慢性日光損傷、紫外線輻射有關的皮膚腫瘤性疾病。三者生物學行為雖有所不同，但卻有某些共同特點：好發(fā)于老年人，曝光部位多見，病理均表現為上皮細胞異常過度增生[1-3]。目前表皮腫瘤的發(fā)病率全球范圍內增長[4]，其發(fā)病機制的研究顯得尤為重要。

轉化生長因子β(Transforming Growth Factor β, TGFβ)對細胞生長、分化、凋亡、遷移、細胞粘附和免疫反應等發(fā)揮重要作用，參與皮膚老化、紫外線照射損傷及表皮腫瘤的發(fā)生[5]。經典TGFβ信號通過激活Smad蛋白發(fā)揮生理作用。Smads蛋白分為受體活化型Smad(R-SMADs)、共同通路型Smad(Co-Smad)以及抑制型Smad(I-Smad)。Smad7及Smad6屬于抑制性Smad蛋白[6]。人類Smad7基因位于18號染色體，其通過與活化TGFβ受體I結合以及使R-Smads與Co-Smad復合物形成等來抑制TGFβ信號。研究表明，Smad7可對抗TGF-β介導的纖維化、致癌和炎癥，提示Smad7有治療這些疾病的潛力[7]。本文旨在探討Smad7在脂溢性角化病、日光性角化病以及基底細胞癌中的表達并探討其臨床意義。

1 材料及方法

1.1 組織標本 SK標本，AK標本，BCC標本及正常標本(NS)各30例，均來自本院。臨床和人口資料取自患者檔案，所有病例都經兩位皮膚科醫(yī)師在未知皮損部位、年齡和性別情況下重新評估。石蠟包埋的組織經常規(guī)HE染色分別確診為SK, AK, BCC及正常標本。正常對照取自整形科手術切除的正常皮膚。所有患者均無炎癥系統(tǒng)性疾病或伴有內臟腫瘤，術前均未進行放、化療。各組年齡及性別均無統(tǒng)計學差異(表 1)。

表1 標本的性別及年齡分布

1.2 試劑 Smad7抗體購自美國Santa Cruz公司(sc-11392)，稀釋濃度為1∶300；免疫組化試劑盒(封閉液、二抗、SAB復合物以及DAB顯色試劑)購自武漢博士德生物有限公司。

1.3 免疫組化 將石蠟包埋組織塊切成4 μm厚的組織片，貼于硅烷涂布的載玻片上。采用SABC法進行免疫組化染色。步驟如下：二甲苯脫蠟20 min，經過梯度酒精溶液水化，用3% H2O2溶液封閉內源性過氧化物酶20 min。組織切片置于PH值為6.0的10 mmol/L的枸櫞酸鹽緩沖液中用微波爐加熱法抗原修復10 min，10%正常山羊血清封閉非特異性結合30 min。組織切片上加Smad7抗體后4℃過夜孵育。辣根過氧化物酶標記的抗兔免疫球蛋白作為二抗室溫孵育20 min，SABC復合物37℃孵育20 min。DAB作為顯色劑，蘇木精作為復染劑，依次加入。依照試劑說明，在以上每一步操作后用PBS清洗玻片。除了特殊說明外，所有孵育均在常溫下進行。胃癌組織作為陽性對照，PBS用作空白對照。

1.4 結果判定 Smad7染色后，每個標本隨機選擇三個高倍視野 (HPFs,×200) ，每個視野都數出100個角質細胞，計算出三個視野中的平均陽性細胞率。采用半定量評估方法將染色分為四個等級:陰性(-)、弱陽性(+)、陽性(++)以及強陽性(+++)[8]，見表 2。

表2 半定量評估方法

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 16.0軟件分析結果。計數資料采用卡方檢驗,多組之間陽性細胞率的比較使用方差分析，其中兩兩比較采用方差分析LSD法。P<0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Smad7在正常皮膚的表達 在正常皮膚標本中，Smad7弱陽性或陰性表達，少量表達于表皮基底層的細胞質(圖1)。

2.2 Smad7在SK中的表達 在30例SK中，23例(77%)陽性表達(見表3)；大部分SK標本中，Smad7中等陽性染色，主要表達于表皮基底層及棘層的細胞質(圖2)；SK標本中Smad7的陽性細胞率明顯高于正常標本(見表4)。根據病理分型[9]，在30例SK中，角化過度型8例，棘層肥厚型11例，腺樣型5例，克隆型6例，其陽性細胞率無統(tǒng)計學差異(F=0.043,P>0.05)。

表3 Smad7的表達 例

2.3 Smad7在AK中的表達 在30例AK中，23例(77%)陽性表達(見表3)；大部分AK標本中，Smad7中等陽性和強陽性染色，表達于表皮全層的細胞質(圖3)；AK標本中Smad7的陽性細胞率明顯高于正常標本(見表5)。根據病理分型[9]，在30例AK中，萎縮型8例，肥厚型6例，原位癌樣型6例，棘層松解型10例，其陽性細胞率無統(tǒng)計學差異(F=0.962,P>0.05)。

表4 SK,AK,BCC與正常組織中Smad7陽性率的比較

表5 Smad7表達的陽性細胞率

表6 Smad7陽性細胞率的兩兩比較

圖1 1a：PBS陰性對照在正常組織中陰性表達(免疫組化，×200)；1b、1c：Smad7在正常皮膚組織中弱陽性表達(免疫組化，×200，×400)圖2 2a：PBS陰性對照在SK中陰性表達(免疫組化，×200)；2b、2c:Smad7在SK組織中等陽性表達(免疫組化，×200，×400)圖3 3a:PBS陰性對照在AK中陰性表達(免疫組化，×200)；3b、3c：Smad7在AK組織強陽性表達(免疫組化，×200，×400)圖4 4a:PBS陰性對照在BCC中陰性表達(免疫組化，×200)；4b、4c:Smad7在BCC組織中強陽性表達(免疫組化，×200，×400)

2.4 Smad7在BCC中的表達 在30例BCC中，28例(93%)陽性表達(表3)；大部分BCC標本中，Smad7強陽性染色，表達于表皮全層及腫瘤細胞的細胞質(圖4)；BCC標本中Smad7的陽性細胞率明顯高于正常標本(表5)。根據病理分型[9]，在30例BCC中，結節(jié)型10例，淺表型9例，纖維上皮瘤樣型8例，腺樣型3例，其陽性細胞率無統(tǒng)計學差異(F=0.394,P>0.05)。

2.5 統(tǒng)計分析結果 SK,AK,BCC中Smad7的陽性率明顯高于正常組織，差異有統(tǒng)計學意義，而SK、AK、BCC三者的陽性率比較無統(tǒng)計學差異(χ2=3.801,P=0.15)(見表4,5)。SK、AK、BCC中Smad7的陽性細胞率明顯高于正常組織，差異有統(tǒng)計學意義；BCC的陽性細胞率明顯高于SK與AK,差異有統(tǒng)計學意義；SK與AK的陽性細胞率比較無統(tǒng)計學差異(見表6)。

3 討論

TGFβ信號在腫瘤不同時期發(fā)揮不同作用。在腫瘤早期，TGFβ是抑制因子，抑制細胞增殖，促進細胞凋亡；在腫瘤晚期，TGFβ促進上皮間質轉化(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT)，參與惡性腫瘤的侵襲及轉移。此外，TGFβ還可通過促進血管生成等參與腫瘤侵襲。Smad7作為TGFβ信號的拮抗劑，比Smad6擁有更多的 TβRI結合位點，因此Smad7比Smad6發(fā)揮更重要的拮抗作用。Smad7在許多惡性腫瘤中高表達，其表達程度與惡性程度呈正相關，并且對腫瘤不同時期的轉換起到“開關”作用。此外，高表達的Smad7可以增強表皮生長因子(Epidermal growth factor, EGF)受體信號的穩(wěn)定性，從而增強由EGF介導的細胞增殖，進而調控腫瘤病程[10]。基于這些機制，研究發(fā)現Smad7在許多惡性腫瘤中高表達，例如乳腺癌、結直腸癌、前列腺癌、膽汁癌、甲狀腺癌、B細胞淋巴瘤、黑素瘤等[11]。Liu等人利用化學誘導方法制造小鼠皮膚腫瘤模型，使用原癌基因轉染的角質細胞Smad7高表達，進而導致良性腫瘤上皮細胞的轉化和鱗狀細胞癌的迅速發(fā)展[12]。

本實驗中， SK,AK及BCC的Smad7陽性細胞率均明顯高于正常標本，并且BCC的陽性細胞率又明顯高于SK與AK。我們推測，Smad7的高表達，導致TGFβ、EGF等信號紊亂，進而導致SK,AK以及BCC發(fā)病，并且Smad7有可能是致癌因子，甚至影響其預后。有研究表明，被不同劑量的紫外線輻射后的AK組織中Smad7的含量明顯升高,而Smad7在鱗狀細胞癌中高表達[13]，這進一步說明Smad7促進了皮膚腫瘤的發(fā)展。而Javelaudl等[14，15]的研究發(fā)現Smad7在轉移性黑素瘤細胞中有腫瘤抑制作用。故Smad7在皮膚中有促進腫瘤及抑制腫瘤兩種作用。由此可見，Smad7不僅僅是TGFβ信號的拮抗劑，它可能還是許多腫瘤侵襲和轉移的啟動子[16]，其在AK,SK,BCC等非色素細胞腫瘤與色素性腫瘤中的致病機制可能有所不同。

Smad7的這種矛盾的雙重角色在腫瘤性疾病的研究中異常重要。但是這兩種角色切換的具體機制還不明確，可能與疾病種類以及Smad7基因突變等有關，Smad7有希望成為表皮腫瘤疾病的理想靶點。