程 玉 劉 曼 王明娟 薛 晶

(承德醫(yī)學院, 1 病理學教研室, 2 附屬醫(yī)院病理科, 承德 067000)

據(jù)估計,全球每年新增胃癌病例95.16萬,死亡病例72.31萬,包括中國在內(nèi)的東亞地區(qū)是該疾病的高發(fā)區(qū)域[1]。在我國,其發(fā)病率男性中排名第二,女性中排名第三[2]。目前對于胃癌發(fā)病機制的認識還很局限,認為是多個信號通路參與的復雜過程。近年來研究表明,Hedgehog過表達與胃癌細胞增殖與轉(zhuǎn)移關系密切,但其具體作用機制目前還無定論?？p隙連接蛋白43(Cx43)是縫隙連接蛋白家族中的重要成員,其能維持正常細胞間信息交換、調(diào)節(jié)細胞增殖與分化[3]。目前有研究表明,Hedgehog可通過調(diào)節(jié)在乳腺癌細胞Cx43蛋白表達從而促進癌細胞增殖[4],然而Hedgehog通路能否通過調(diào)控Cx43從而調(diào)節(jié)胃癌細胞的增殖及凋亡查閱文獻,尚未見相關報道。本研究應用Hedgehog通路抑制劑cyclopamine阻斷該通路,觀察胃癌細胞MGC-803細胞增殖和凋亡能力變化,以及其對縫隙連接蛋白Cx43 mRNA及蛋白表達的影響,初步探討此通路在胃癌細胞增殖及凋亡中的作用機制。

1 材料和方法

1.1 細胞及試劑

人胃癌MGC-803細胞由承德醫(yī)學院基礎醫(yī)學研究所饋贈;cyclopamine、MTT及DMSO均購自北京索萊寶科技有限公司;RPMI-1640培養(yǎng)基及胰酶購自Gibco公司;胎牛血清購自四季青;TUNEL試劑盒購自羅氏公司;qRT-PCR試劑盒購自北京天根生化科技有限公司;Cx43多克隆抗體購自Bioworld;所用引物由TaKaRa設計合成,引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2 細胞培養(yǎng)

將MGC-803細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中,置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育。細胞融合度達到60%～70%時,胰蛋白酶消化,1∶3傳代。

1.3 MTT法檢測細胞增殖抑制率

收集對數(shù)期MGC-803細胞,細胞濃度調(diào)整為5×104/ml 分于96孔板中,置于37℃、5% CO2溫箱中培養(yǎng)。24h后,吸掉各孔內(nèi)的培養(yǎng)基,加入濃度分別為5、10、20、30、40、50μmol/L的cyclopamine,同時設立空白對照0μmol/L。繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72h后,加入20μl MTT溶液,繼續(xù)孵育4h。終止培養(yǎng),小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液,每孔加入DMSO 100μl,置于水平搖床上震蕩10min。在酶聯(lián)免疫檢測儀490nm處測定吸光度。同時設置調(diào)零孔、對中孔,每孔設3復孔。

1.4 TUNEL檢測細胞凋亡率

取對數(shù)生長期的MGC-803細胞,胰蛋白酶消化至懸液,將細胞接種于6孔板,每孔2ml,置于溫箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24h,吸棄原培養(yǎng)基,加入不同濃度的cyclopamine(0、30、40μmol/L),處理48h后,棄上清。嚴格按照試劑盒說明書步驟,經(jīng)過水合、細胞通透、加TUNEL反應液等步驟,最后放于暗濕盒中反應37℃,1h,加1滴PBS再計數(shù)凋亡細胞。

1.5 qRT-PCR檢測Cx43 mRNA的表達

加入不同濃度cyclopamine(0、30、40μmol/L)之后,放于溫箱內(nèi)培養(yǎng)48h后,用TRIzol提取細胞總RNA,用PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA轉(zhuǎn)成cDNA,用SYBR Premix Ex Taq II反應體系進行PCR擴增,反應條件： 95℃預變性30s,95℃ 變性40s,60℃退火30s,共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參,2-△△ct方法計算mRNA的相對表達水平。

1.6 免疫印跡檢測Cx43蛋白表達

收集MGC-803細胞,用RIPA裂解液提取總蛋白,BCA法檢測蛋白濃度。收集的蛋白樣品中加入5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液,沸水浴加熱3～5min,充分變性蛋白。直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi),每孔20μg,常規(guī)電泳及轉(zhuǎn)膜,硝酸纖維膜于5%脫脂奶粉中室溫封閉1h,加入Cx43(1∶500)及β-actin一抗,4℃孵育過夜。經(jīng)TBST洗膜后,加入對應的二抗,室溫孵育1h。再經(jīng)TBST洗膜,ECL化學發(fā)光曝光顯影。用Image J圖像軟件分析目的條帶,計算相對表達量。

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 MGC-803細胞增殖抑制率

MTT實驗結果顯示,與空白對照組相比,經(jīng)30、40μmol/L cyclopamine處理48h后,MGC-803細胞增殖抑制率明顯升高(P<0.05,P<0.01)(圖1)。

圖1 各組MGC-803細胞增殖抑制率

2.2 MGC-803細胞凋亡率

TUNEL結果顯示,MGC-803細胞經(jīng)30、40μmol/L cyclopamine處理48h后,與空白對照組相比,處理組細胞凋亡率明顯升高(P<0.01)(圖2)。

2.3 Cx43 mRNA表達

30、40μmol/L cyclopamine作用細胞48h后,與空白對照組相比,Cx43 mRNA表達水平明顯增高(P<0.05,P<0.01)(圖3)。

圖2 各組MGC-803細胞凋亡率

圖3 Cyclopamine處理后Cx43 mRNA表達變化

2.4 Cx43蛋白表達

30、40μmol/L cyclopamine作用細胞48h后,與空白對照組相比,Cx43蛋白表達水平明顯增高(P<0.05,P<0.01)(圖4)。

圖4 Cyclopamine處理后Cx43 蛋白表達變化

3 討論

在我國胃癌的發(fā)病率和死亡率遠遠高于歐美發(fā)達國家,對國民健康造成了極大的危害,胃癌的高度侵襲性和轉(zhuǎn)移是導致胃癌患者高死亡率的主要原因。胃癌細胞的無限增殖和癌細胞凋亡失控是其侵襲和轉(zhuǎn)移的基礎,但是目前胃癌細胞異常增殖和凋亡的分子機制并不清楚。

近期有研究指出,從慢性炎癥到胃癌的一步步演變過程中,Hedgehog信號通路起著至關重要的作用[5]。該信號通路異常激活與人類多種惡性腫瘤的發(fā)病相關,比如肺癌,肝細胞癌,大腸癌等[6-8]。人類Hedgehog信號通路主要由分泌型信號蛋白Shh配體、跨膜蛋白受體Ptch和另一跨膜蛋白Smo以及下游轉(zhuǎn)錄因子Gli蛋白組成,可簡述為Hh-Ptch-Smo-Gli信號軸[9]。

在細胞實驗中應用非常廣泛的Hedgehog信號通路cyclopamine可以特異性結合和抑制Smo[10]。本實驗應用cyclopamine阻斷Hedgehog信號通路,觀察胃癌MGC-803細胞增殖和凋亡。結果顯示,阻斷Hedgehog通路后胃癌MGC-803細胞增殖活力下降,而細胞凋亡率增高。該結果提示,Hedgehog信號通路可能是胃癌細胞的增殖和凋亡的分子機制。

為了進一步探討Hedgehog信號通路影響胃癌細胞增殖及凋亡的機制,阻斷Hedgehog信號通路后,本研究應用qRT-PCR和免疫印跡分別檢測了Cx43 mRNA和蛋白的表達,結果顯示Cx43 mRNA和蛋白的表達都增多。此研究結果提示,Hedgehog通路可能同時調(diào)節(jié)了Cx43的mRNA和蛋白水平的表達。本課題組前期研究顯示,Cx43 mRNA及蛋白在胃癌組織中表達明顯少于正常胃黏膜中的表達,其參與了胃癌的發(fā)生及發(fā)展,并且與PI3K/Akt等信號通路相關[11]。所以筆者推測,Hedgehog通路作用于胃癌的機制可能與Cx43 mRNA及蛋白相關。Hedgehog通路與Cx43 mRNA及蛋白之間存在一定的關聯(lián),但是主要集中于胚胎細胞方面。有研究者證實[12],在心肌胚胎干細胞發(fā)育過程中具有協(xié)同作用。還有研究表明[13],在胚胎期小鼠的舌中,抑制Cx43基因會阻斷Hedgehog通路。還有一項研究指出[14],Cx43基因突變或者敲除都能導致并指的發(fā)生,其機制是由于Cx43基因突變或者敲除抑制了Hedgehog。新近研究報道,Hedgehog通路可通過影響Cx43蛋白膜表達,從而調(diào)控乳腺癌MCF-7細胞的增殖和凋亡[4]，但是關于胃癌細胞中兩者相互作用關系,目前尚未完全清楚。

綜上所述,本研究證實了Hedgehog信號通路可促進胃癌細胞增殖,抑制細胞凋亡,并且表明該通路影響胃癌細胞增殖和凋亡的機制可能與調(diào)控Cx43 mRNA及蛋白有關。但此研究還存在一些不足,如只是通過阻斷Hedgehog信號通路觀察Cx43 mRNA和蛋白表達變化,后續(xù)還需要通過一系列實驗激活該信號通路再研究Cx43 mRNA和蛋白的表達。此外,Hedgehog信號通路是如何影響Cx43 mRNA和蛋白表達的具體作用機制還有待進一步研究闡明。