田新紅 徐玉英 郝 莉

(河南中醫(yī)藥大學(xué)人體解剖學(xué)與組織學(xué)胚胎學(xué)教研室, 鄭州 450008)

帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是一種常見的中老年神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病,其發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜,多種因素參與該病的發(fā)生和發(fā)展,病理學(xué)方面主要以黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元大量變性丟失為特征[1]。其中細(xì)胞凋亡是PD中多巴胺能神經(jīng)元死亡的主要形式,誘導(dǎo)凋亡的途徑有死亡受體途徑、線粒體應(yīng)激途徑以及后來發(fā)現(xiàn)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress, ERS)途徑。近年來,蛋白質(zhì)代謝異常導(dǎo)致ERS在PD發(fā)病中越來越受到關(guān)注[2]。在前期實(shí)驗(yàn)顯示丹參酮IIA可減輕PD模型大鼠多巴胺能神經(jīng)元的損傷,其作用機(jī)制可能與JNK和p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有關(guān)[3-4]。丹參酮IIA在PD中的具體作用及相關(guān)機(jī)制尚不明確。本研究采用魚藤酮制備PD大鼠模型,觀察丹參酮IIA對(duì)模型大鼠中腦黑質(zhì)內(nèi)酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase, TH)、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein 78， GRP78)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cysteine aspartic acid protease-3, caspase-3)表達(dá)的影響,探討其作用機(jī)制是否與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān),從而為PD的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及模型制備

體質(zhì)量200～220g的健康雄性SD大鼠60只,由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,隨機(jī)分為正常對(duì)照組、假手術(shù)組(Sham組)(n=15)、生理鹽水組(NS組)和丹參酮ⅡA處理組(TSA組,n=15)。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始制作模型,根據(jù)文獻(xiàn)[5]以及本研究預(yù)實(shí)驗(yàn)的經(jīng)驗(yàn)總結(jié),魚藤酮溶解于葵花油配制成濃度為4mg/ml的乳液,采用頸背部皮下注射魚藤酮溶液2mg/kg,每天1次,連續(xù)30d。模型大鼠出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)減少、肌肉震顫、全身抖動(dòng)、四肢僵直等表現(xiàn)提示造模成功[6]。選取30只帕金森病模型大鼠隨機(jī)分為NS組和TSA組,在最后一次注射魚藤酮溶液24h后分別在模型大鼠腹腔注射生理鹽水1ml和丹參酮IIA 20mg/kg,連續(xù)注射14d。假手術(shù)組(此組在模型制備時(shí)作對(duì)照)： 與模型組相同部位注射等量的不含魚藤酮的葵花油,每天1次,連續(xù)30d。正常組(此組在模型制備和藥物干預(yù)時(shí)作對(duì)照)： 未作任何處理,正常飼養(yǎng)。

爬桿實(shí)驗(yàn)： 根據(jù)文獻(xiàn)[7-8]以及本研究預(yù)實(shí)驗(yàn)的經(jīng)驗(yàn)總結(jié),手持鼠尾,令其倒立(頭向下)于50cm長(zhǎng)的木桿頂端,木桿外纏有醫(yī)用膠布以保證足夠的摩擦力,用秒表記錄大鼠完成爬至桿底(后肢著地)全長(zhǎng)所用時(shí)間,評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下： 四肢并用,一次順利從桿上爬下為0分;一步一步螺旋向下爬行兼有后肢滑行行為的為0.5分;上桿后間歇停頓數(shù)次后爬下,但可抱緊金屬桿的為1分;滑行后掉落的為1.5分;不能抓桿,直接掉落為2.0 分。測(cè)量3次取平均值,每次間隔5min。實(shí)驗(yàn)大鼠經(jīng)過提前適應(yīng)訓(xùn)練4d,記錄魚滕酮注射前3d(取平均值),及注射后7、14、21、28d爬桿時(shí)間、狀態(tài)以進(jìn)行評(píng)分;另外,在模型大鼠腹腔注射生理鹽水和丹參酮后第7、14天,測(cè)量并記錄正常對(duì)照組、生理鹽水組和處理組大鼠爬桿時(shí)間、狀態(tài)以進(jìn)行評(píng)分。若大鼠中途停止或反向爬行,則不予記錄,重新測(cè)量。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

魚藤酮和葵花乳油(美國Sigma公司);丹參酮IIA磺酸鈉注射液(每支2ml,10mg)(上海第一生化藥業(yè)有限公司,批號(hào)： H31022558);兔多克隆TH、GRP78、caspase-3抗體(Abcam公司);HRP標(biāo)記羊抗兔二抗和DAB免疫組織化學(xué)試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);TUNEL試劑盒(羅氏(Roche)公司)。

1.3 標(biāo)本的采集

在處理結(jié)束24h后,正常對(duì)照組、NS組和丹參酮IIA組大鼠給予10%的水合氯醛腹腔注射麻醉,固定后開胸并暴露心,用0.9%氯化鈉溶液快速?zèng)_洗至肝泛白,流出液體無血色,再用4%多聚甲醛常規(guī)灌洗固定,待大鼠全身僵硬后,迅速開顱取出中腦部分，置于4%多聚甲醛中固定24h,石蠟包埋切片。

1.4 免疫組織化學(xué)檢測(cè)

將各組大鼠中腦組織進(jìn)行石蠟包埋，切片后依次脫蠟、PBS浸洗、修復(fù)、PBS洗滌;滴加50μl 0.3%H2O2,PBS洗滌;滴加血清封閉,37℃孵育20min;分別加一抗(稀釋倍數(shù)為1∶300),37℃孵育過夜;PBS洗滌,分別加二抗工作液,37℃孵育30min;DAB顯色;蘇木精復(fù)染后依次脫水干燥,中性樹膠封片。根據(jù)染色強(qiáng)度及陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)的多少進(jìn)行評(píng)分： 染色強(qiáng)度(把強(qiáng)度表現(xiàn)為0分的視為陰性;強(qiáng)度表現(xiàn)為1分的視為弱陽性;強(qiáng)度表現(xiàn)為2分的視為中等陽性;強(qiáng)度表現(xiàn)為3分的視為強(qiáng)陽性);陽性細(xì)胞百分率(把無陽性細(xì)胞視為0分;陽性細(xì)胞<25%的視為1分;陽性細(xì)胞25%～50%的視為2分;陽性細(xì)胞>50%的視為3分);2項(xiàng)分?jǐn)?shù)之和為0～2分者,計(jì)為表達(dá)陰性(-),3～4分為弱陽性(+),5～6分者為中度陽性(++),7～9分者為強(qiáng)陽性(+++)。

1.5 TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡

檢測(cè)2組大鼠脊髓背角細(xì)胞凋亡的情況。操作步驟參照TUNEL原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行。結(jié)果判定： 細(xì)胞核著棕黃色者為陽性細(xì)胞。每個(gè)標(biāo)本觀察1張玻片,隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野(40×10),每視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞中的陽性細(xì)胞數(shù),凋亡細(xì)胞陽性指數(shù)(AI)=(凋亡陽性細(xì)胞數(shù)/總計(jì)細(xì)胞數(shù))×100%。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 外觀和行為學(xué)改變

正常組及假手術(shù)組大鼠皮毛光滑,活動(dòng)、飲食如常,體質(zhì)量增長(zhǎng)。與正常對(duì)照組及假手術(shù)組比較,模型組大鼠在注射魚藤酮7～10d即出現(xiàn)毛色變黃變臟、拒捕行為減弱等表現(xiàn),隨著用藥時(shí)間的延長(zhǎng),這些癥狀逐漸加重,且出現(xiàn)主動(dòng)活動(dòng)減少、動(dòng)作遲緩、步態(tài)不穩(wěn)等表現(xiàn);第19～23天出現(xiàn)不同程度的豎毛、震顫、四肢肌張力增高、協(xié)調(diào)性差等,之后上述表現(xiàn)愈加明顯,自發(fā)性活動(dòng)減少、運(yùn)動(dòng)減緩甚至不能。

圖1 三組大鼠中腦黑質(zhì)內(nèi)TH、GRP78、caspase-3和細(xì)胞凋亡的變化,標(biāo)尺=50μm

爬桿實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,正常組和假手術(shù)組的大鼠均能夠四肢并用,一次順利從桿頂爬到桿底,中間無停留,各時(shí)間點(diǎn)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與正常組和假手術(shù)組比較,模型組隨著魚滕酮注射時(shí)間的延長(zhǎng),大鼠爬竿持續(xù)時(shí)間逐漸延長(zhǎng),第22天以后,表現(xiàn)為抱桿不穩(wěn),不敢下爬甚至不能抱桿、墜落,比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,表1)。在模型大鼠腹腔注射生理鹽水和丹參酮IIA后爬桿實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組比較,NS組大鼠均表現(xiàn)為抱桿不穩(wěn),不敢下爬甚至不能抱桿、墜落,比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,表2);與NS組比較,TSA組在注射丹參酮IIA后第7天,大鼠自發(fā)性活動(dòng)明顯增多;至第14天,大鼠能夠抱桿,但容易滑落,比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,表2)。

表1 各組大鼠爬桿實(shí)驗(yàn)評(píng)分比較分)

**P<0.01vscontrol group and NS group

表2 各組大鼠爬桿實(shí)驗(yàn)評(píng)分比較分)

*P<0.05vscontrol group and NS group

2.2 TH、GRP 78和caspase-3的表達(dá)及細(xì)胞凋亡的變化

免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示,TH、GRP78和caspase-3的陽性表達(dá)部位主要分布在細(xì)胞質(zhì)。與正常對(duì)照組比較,NS組大鼠中腦黑質(zhì)內(nèi)TH的表達(dá)降低,GRP78和caspase-3的表達(dá)增多;與NS組比較,TSA組大鼠中腦黑質(zhì)內(nèi)TH的表達(dá)增多,GRP78和caspase-3的表達(dá)降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,圖1)。

原位末端標(biāo)記在凋亡細(xì)胞顯黃褐色即為陽性細(xì)胞。與正常對(duì)照組比較,NS組大鼠中腦黑質(zhì)內(nèi)有較多的凋亡陽性細(xì)胞;與NS組比較,TSA組大鼠中腦黑質(zhì)內(nèi)凋亡陽性細(xì)胞明顯減少,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖1)。

3 討論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能失調(diào)導(dǎo)致未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)堆積的一種狀態(tài)稱內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[9]。在ERS初期,細(xì)胞可啟動(dòng)生存途徑[10],但嚴(yán)重或長(zhǎng)時(shí)間的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損傷時(shí),細(xì)胞則啟動(dòng)由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所介導(dǎo)的凋亡信號(hào)通路,凋亡途徑最終通過caspase-3的活化而實(shí)施[11]。GRP78是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的標(biāo)志性蛋白,其含量的增加表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生了應(yīng)激反應(yīng)。本研究采用頸背部皮下注射魚藤酮復(fù)制PD大鼠模型,隨著用藥時(shí)間的延長(zhǎng),逐漸出現(xiàn)自發(fā)性活動(dòng)減少、運(yùn)動(dòng)減緩甚至不能、四肢肌張力增高,協(xié)調(diào)性差,震顫等典型的行為學(xué)表現(xiàn)。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示模型大鼠中腦黑質(zhì)內(nèi)TH的表達(dá)降低,表明黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元大量丟失,本實(shí)驗(yàn)PD模型復(fù)制成功,符合實(shí)驗(yàn)要求。

丹參酮IIA是一種從中藥丹參中提取的主要有效成分,丹參酮IIA可能具有抗炎和抗氧化能力,對(duì)治療帕金森病有一定價(jià)值[12-14]。另有學(xué)者報(bào)道,丹參酮IIA具有抗凋亡作用[15]。本實(shí)驗(yàn)室前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示丹參酮IIA可減輕PD模型大鼠多巴胺能神經(jīng)元的損傷,其作用機(jī)制可能與JNK和p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有關(guān)[3-4]。本研究在魚藤酮制備的PD大鼠模型上觀察丹參酮IIA對(duì)模型大鼠中腦黑質(zhì)內(nèi)TH、GRP78、caspase-3的表達(dá)和細(xì)胞凋亡的影響,結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組比較,生理鹽水組大鼠中腦黑質(zhì)內(nèi)TH的表達(dá)降低,GRP78和caspase-3的表達(dá)增多;凋亡染色陽性細(xì)胞數(shù)目增多。與生理鹽水組比較,處理組大鼠中腦黑質(zhì)內(nèi)TH的表達(dá)增多,GRP78和caspase-3的表達(dá)降低,凋亡染色陽性細(xì)胞數(shù)目減少,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示丹參酮IIA可在一定程度上阻抑魚藤酮誘導(dǎo)的PD模型大鼠中腦黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元的丟失,其神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制可能與減弱內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。丹參酮IIA可能是一個(gè)潛在的治療PD的藥物,在后續(xù)試驗(yàn)中將對(duì)其與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的生存途徑和凋亡途徑之間的關(guān)系做進(jìn)一步研究。