孫丹華 陳旭東 徐紀(jì)偉

(漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部, 漯河 462002)

脊髓損傷后神經(jīng)功能難以恢復(fù),這是因?yàn)樯窠?jīng)細(xì)胞再生修復(fù)能力較弱以及損傷區(qū)域出現(xiàn)大量炎癥介質(zhì)、過氧化物、鈣離子及神經(jīng)生長(zhǎng)抑制因子[1],神經(jīng)細(xì)胞受到毒性損傷,因此改善脊髓內(nèi)微環(huán)境,減少炎癥因子,才能激活內(nèi)源性再生系統(tǒng),有利于神經(jīng)功能恢復(fù)[2]。蛹蟲草是我國(guó)傳統(tǒng)珍貴中藥材,它性甘、溫平、無毒,具有抗炎、抗自由基、免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤等藥理作用,它的有效活性成分是蟲草素即3′-脫氧腺苷[3-4]。本研究采取蟲草素治療脊髓半橫切損傷,用免疫組織化學(xué)方法和免疫印跡觀察突觸分化誘導(dǎo)基因1(synapse differentiation induced gene 1, SynDIG1)表達(dá),用BBB評(píng)估體系和斜板試驗(yàn)評(píng)價(jià)肢體運(yùn)動(dòng)情況,探討神經(jīng)損傷修復(fù)的內(nèi)在機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

選取200～220g SD雌性大鼠240只(中原正大實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,合格證： SCXK豫2010-0002)。

蟲草素購自于美國(guó)Sigma公司;小鼠抗大鼠SynDIG1抗體購自密理博公司;FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、生物素化山羊抗小鼠IgG、ABC試劑均購自中杉生物公司;Leica CM1850恒冷箱冰凍切片機(jī)購自Leica儀器有限公司;熒光顯微鏡購自中國(guó)奧卡光學(xué)儀器有限公司。

1.2 動(dòng)物模型

動(dòng)物隨機(jī)分成對(duì)照組、損傷組、低劑量和高劑量治療組。脊髓損傷模型,用戊巴妥鈉麻醉大鼠,將其四肢固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上,剪除皮毛消毒,切開后背正中皮膚,分離皮下組織和肌肉,咬除第9、10胸椎棘突及椎板,露出脊髓組織,快速切斷一側(cè)脊髓,縫合傷口,注射抗生素。

低、高劑量治療組分別給予腹腔注射蟲草素5mg/kg、12.5mg/kg,1周后停藥,損傷組用0.9%NaCl代替蟲草素,對(duì)照組僅給予抗感染治療。

1.3 取材和切片

術(shù)后14、21、28、35d,每組每時(shí)點(diǎn)選5只動(dòng)物。用戊巴妥鈉麻醉大鼠,打開胸腔露出心,將針頭插入左心室至升主動(dòng)脈,切開右心房,注入0.9%NaCl 250ml,待流出液體清亮注入4%多聚甲醛300ml,咬除棘突和椎板,暴露脊髓組織,取損傷區(qū)脊髓組織,行OCT包埋切片。

1.4 免疫熒光染色

切片滴加SynDIG1抗體,4℃過夜,PBS洗3次,每次5min,再滴加FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG,4℃孵育12h,PBS洗3次,每次5min,甘油封片,在熒光顯微鏡下觀察。陰性對(duì)照不加一抗,只加二抗。鏡下觀察到綠色神經(jīng)細(xì)胞即為SynDIG1陽性細(xì)胞,每只動(dòng)物取5張切片計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞總數(shù),取每個(gè)時(shí)點(diǎn)平均值。

1.5 行為學(xué)評(píng)價(jià)方法

1.5.1 斜板試驗(yàn) 將各組大鼠置于一塊平坦但不光滑的斜板上,斜板由零度緩慢上升,每次升高5°,至大鼠停留原有位置而不跌落5s時(shí)讀取斜板度數(shù),每只大鼠重復(fù)3次取平均值。

1.5.2 BBB運(yùn)動(dòng)評(píng)分 將動(dòng)物放入帶條紋的地板,輕敲盆壁使其爬行。觀察臀、膝、踝的運(yùn)動(dòng),觀察腳掌負(fù)重站立和軀干協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)情況,觀察后腳爪伸展著地和尾巴的平衡情況。

1.6 免疫印跡

術(shù)后5個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組取5只動(dòng)物取材,取損傷區(qū)脊髓組織并研磨,冰上靜置1h,低溫高速離心15min,吸取上清待用,用SDS-PAGE不連續(xù)緩沖系統(tǒng)電泳,將PVDF膜放入TBST(含50g/L脫脂奶粉)封閉2h,TBS洗3次,每次5min;滴加SynDIG1抗體(1∶500),4℃過夜,TBS洗3次,每次5min,滴加生物素化山羊抗小鼠IgG(1∶500),放置2h,TBS洗3次,每5min,加ABC試劑,DAB顯色,測(cè)目的條帶與β-actin條帶的吸光度值比值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 蟲草素治療明顯增加損傷脊髓的SynDIG1表達(dá)

術(shù)后第14天,高、低劑量治療組和損傷組脊髓內(nèi)均有SynDIG1陽性神經(jīng)細(xì)胞,在28d達(dá)到高峰,之后呈高水平表達(dá),且SynDIG1陽性神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量高劑量治療組明顯高于低劑量治療組,低劑量治療組明顯高于損傷組,而對(duì)照組則無SynDIG1陽性神經(jīng)細(xì)胞(圖1,表1)。

圖1 脊髓損傷后28d各組SynDIG1表達(dá),免疫熒光染色,×200,標(biāo)尺=50μm

表1 脊髓損傷后各時(shí)間點(diǎn)SynDIG1陽性神經(jīng)元數(shù)量

*P<0.05vsinjury group;△P<0.05vslow dose treatment group;#P<0.05vshigh dose treatment group

2.2 蟲草素增加損傷脊髓的SynDIG1的含量

術(shù)后第14天,高、低劑量治療組和損傷組的脊髓內(nèi)出現(xiàn)SynDIG1表達(dá),且呈現(xiàn)逐漸升高趨勢(shì),一直到損傷后第28天達(dá)到峰值,之后一直維持在較高水平;并且SynDIG1表達(dá)水平高劑量治療組明顯高于低劑量治療組,低劑量治療組明顯高于損傷組,對(duì)照組則未見SynDIG1表達(dá)(圖2)。

2.3 蟲草素改善脊髓損傷大鼠的BBB評(píng)分

所有動(dòng)物術(shù)前評(píng)分為21分,在術(shù)后14d對(duì)照組評(píng)分達(dá)到20分,功能基本恢復(fù)正常。高、低劑量治療組和損傷組BBB評(píng)分呈現(xiàn)逐漸升高趨勢(shì),且術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)高劑量治療組BBB運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分明顯高于低劑量治療組和損傷組,低劑量治療組BBB運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分明顯高于損傷組(表2)。

2.4 蟲草素提高脊髓損傷大鼠斜板試驗(yàn)評(píng)分

術(shù)前動(dòng)物斜板試驗(yàn)角度達(dá)70°～75°,術(shù)后斜板試驗(yàn)角度至20°,表明模型制作成功。高、低劑量治療組和損傷組斜板試驗(yàn)角度呈現(xiàn)逐漸增大趨勢(shì),且術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)高劑量治療組斜板試驗(yàn)角度明顯大于低劑量治療組和損傷組,低劑量治療組斜板試驗(yàn)角度明顯大于損傷組(表3)。

圖2 免疫印跡檢測(cè)各組脊髓SynDIG1的表達(dá)

表2 術(shù)后各組BBB評(píng)分比較 分)

*P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsinjury group;#P<0.05vslow dose treatment group

表3 術(shù)后各組斜板試驗(yàn)比較

*P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsinjury group;#P< 0.05vslow dose treatment group

3 討論

脊髓損傷后由于機(jī)械性破壞組織結(jié)構(gòu)導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷和凋亡,同時(shí)由于大量的炎癥因子和自由基釋放、鈣離子內(nèi)流失衡、調(diào)亡基因大量表達(dá),這些因素將會(huì)引起細(xì)胞周期停滯,損傷DNA,引發(fā)細(xì)胞凋亡,特別是炎癥因子會(huì)促使神經(jīng)突觸囊泡內(nèi)的谷氨酸大量釋放,使神經(jīng)細(xì)胞受到谷氨酸興奮性毒性損傷,進(jìn)一步加重神經(jīng)損傷[9]。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)中腺苷具有調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)釋放、神經(jīng)突觸可塑性、缺血性神經(jīng)保護(hù)等作用。腺苷是通過4個(gè)亞型受體(A1、A2A、A2B和A3)發(fā)揮藥理活性,其中A1受體可以調(diào)節(jié)突觸傳導(dǎo)和神經(jīng)元超極化,A2A受體調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)釋放,A2B受體調(diào)節(jié)cAMP水平和鈣離子通道,A3受體調(diào)節(jié)神經(jīng)突觸可塑性[10]。蟲草素是3′-脫氧腺苷,屬于一種腺苷的衍生物,藥物動(dòng)力學(xué)顯示腺苷衍生物是通過腺苷轉(zhuǎn)運(yùn)體經(jīng)血腦屏障作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng),它可以激活A(yù)1、A2A和A3受體,調(diào)節(jié)活性氧和鈣離子信號(hào)通路,減少由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引發(fā)的半脫天冬氨酸蛋白酶12高表達(dá),抑制神經(jīng)細(xì)胞死亡,發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[11]。此外，蟲草素還可以激活T淋巴細(xì)胞,促進(jìn)單核細(xì)胞分泌IL-10,從而降低TNF-α和IL-1b 表達(dá)水平,發(fā)揮抗炎癥作用[12];蟲草素還可逆轉(zhuǎn)由脂多糖誘導(dǎo)NF-kB表達(dá)和抑制Akt與p38磷酸化,減少NOS1、NOS2轉(zhuǎn)錄表達(dá),清除內(nèi)源性NO,減輕海馬神經(jīng)氧化應(yīng)激神經(jīng)損傷,促進(jìn)生長(zhǎng)錐發(fā)育和樹突棘形成[13-15];蟲草素還能降低腦組織內(nèi)谷氨酸鹽和天冬氨酸鹽水平,減少丙二醛的含量,激活超氧化物歧化酶,發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[16-17];蟲草素還可以清除活性氧自由基,抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活,對(duì)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用[18]。蟲草素的抗炎、抗自由基、免疫調(diào)節(jié)作用,有利于改善神經(jīng)損傷區(qū)域微環(huán)境,促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。

SynDIG1是最新發(fā)現(xiàn)與突觸分化、發(fā)育密切相關(guān)的跨膜蛋白,具有介導(dǎo)神經(jīng)快速興奮性突觸傳遞作用,參與調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)記憶活動(dòng)特性的調(diào)節(jié)蛋白,通過改變神經(jīng)細(xì)胞SynDIG1表達(dá)水平顯示興奮性突觸在數(shù)量和功能等方面出現(xiàn)顯著變化。目前研究表明SynDIG1興奮性突觸傳遞與AMPAR有密切關(guān)系,當(dāng)SynDIG1過表達(dá)時(shí)AMPA含量也隨之增加,當(dāng)敲除SynDIG1基因時(shí)AMPA含量也隨之降低。在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)AMPA受體主要分布在突觸后膜上,它包含GluR1～GluR4 4個(gè)亞基,每個(gè)亞基由N端1個(gè)、跨膜區(qū)域3個(gè)、有孔發(fā)夾結(jié)構(gòu)1個(gè)和C端1個(gè)構(gòu)成[19],其中GluR1磷酸化水平與突觸遷移和膜定位密切相關(guān),在突觸位點(diǎn)GluR1變化水平與LTP和LTD相關(guān),即GluR1磷酸化水平越高,突觸位點(diǎn)的LTP越強(qiáng)[20]。研究表明神經(jīng)細(xì)胞經(jīng)蟲草素預(yù)處理后,可顯著提升GluR1在小鼠前額葉皮層和海馬體突觸表達(dá)水平,但是GluR2表達(dá)水平則沒有發(fā)生明顯變化。蟲草素可以通過特異AMPA受體亞基GluR1/3調(diào)控突觸傳導(dǎo),GluR1 Ser845是一個(gè)蛋白激酶A位點(diǎn),該位點(diǎn)磷酸化激活神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)AMPA受體,增加受體在神經(jīng)細(xì)胞膜嵌入,促進(jìn)LTP的發(fā)生,且蟲草素劑量越高、磷酸化作用越強(qiáng)、AMPA受體含量越多,且可發(fā)生反饋性作用,進(jìn)而調(diào)節(jié)神經(jīng)突觸可塑性[21-23]。

免疫熒光、免疫印跡研究結(jié)果顯示脊髓損傷后用蟲草素可以促使神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)SynDIG1大量表達(dá),減少組織囊性空腔和減輕炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況。這是因?yàn)橄x草素不僅可以清除過氧化物酶、激活超氧化物歧化酶、減輕鈣超載、促使免疫細(xì)胞分泌抗炎因子,抑制細(xì)胞凋亡,而且它還可以促使GluR1磷酸化,提升GluR1表達(dá)水平,激活A(yù)MPA受體,從而反饋性促進(jìn)SynDIG1大量表達(dá),調(diào)節(jié)神經(jīng)突觸分化、發(fā)育及興奮性傳遞作用,最終改善神經(jīng)損傷區(qū)域微環(huán)境、有利于神經(jīng)再生。

行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,蟲草素治療脊髓損傷能有效促進(jìn)動(dòng)物的肢體運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù),并且在術(shù)后第14天動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分就已明顯高于損傷組,神經(jīng)系統(tǒng)功能恢復(fù)良好。蟲草素對(duì)脊髓內(nèi)SynDIG1表達(dá)的影響與其對(duì)運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的影響表現(xiàn)出趨勢(shì)一致,這個(gè)現(xiàn)象也從側(cè)面說明脊髓內(nèi)微環(huán)境得到了極大的改善,啟動(dòng)了內(nèi)源性神經(jīng)修復(fù)系統(tǒng),但具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

綜上所述,蟲草素明顯改善損傷區(qū)域的微環(huán)境,激活神經(jīng)系統(tǒng)的內(nèi)源性修復(fù)機(jī)制,促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞SynDIG1大量表達(dá),有利于神經(jīng)再生及神經(jīng)系統(tǒng)運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。