馬華根 唐元瑜 紀立金

(福建中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院， 1 2016級中醫(yī)專業(yè)5年制本科， 2 中醫(yī)基礎理論教研室， 福州 350122)

腦微血管內(nèi)皮細胞(brain microvascular endothelial cells, BMECs)是構成血腦屏障的主要成分之一,它能通過選擇性雙向跨細胞膜轉(zhuǎn)運系統(tǒng)及細胞間的緊密連接將腦組織與體循環(huán)分隔開,限制蛋白質(zhì)和大多數(shù)極性分子進入腦組織,只有少部分蛋白質(zhì)和多肽能以轉(zhuǎn)胞吞方式通過血腦屏障進入血液[1];并且BMECs在腦的物質(zhì)代謝、纖溶與止血、免疫應答等方面也發(fā)揮著重要作用,與腦水腫、腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展、腦腫瘤的浸潤和擴散,尤其是腦腫瘤的血管生成等病理過程密切相關[2-3]。因此,體外分離培養(yǎng)出BMECs對于后期開展腦血管疾病研究有著重要的奠基意義。而BMECs的體外分離純化難度較大,國內(nèi)外雖有相關報道,但各自的培養(yǎng)方法有所不同,尤其是在腦微血管段的分離與細胞純化方面有較大差異[4]。本課題組參考國內(nèi)外相關文獻,反復試驗,多次調(diào)整實驗方案后,成功獲得了數(shù)量足夠、純度較高、活性較好的大鼠腦微血管段,并體外培養(yǎng)出大鼠BMECs。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

7～10日齡Sprague Dawley大鼠4只,雌雄不限,購自福建醫(yī)科大學實驗動物中心。

1.2 主要試劑及儀器

胎牛血清(P161102ES, Pansera公司);M199培養(yǎng)基(1839543, Gibco公司);胰蛋白酶-EDTA混合消化酶液(20170602,南京凱基生物公司);碳酸氫鈉(E1724004,阿拉丁公司);肝素(120904,南京新百藥業(yè)有限公司);磷酸鹽緩沖液(P1010)、Triton X-100 (T8200, Solarbio公司);牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)(WXBC44547V)、明膠原蛋白(WXBC4232V, Vetec公司);Ⅱ型膠原酶(461699)、DNaseI酶(25F10220,北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司);L-谷氨酰胺(56-85-9)、HEPES(7365-45-9)、嘌呤霉素(CA0070, Leagene公司);兔IgG—免疫組織化學試劑盒SABC即用型(12F07A)、4%多聚甲醛(12D08A68)、rabbit anti-Ⅷ因子抗體(ZP1226BBP26)、DAB顯色劑(12F08A22,武漢博士德生物公司)。

美國Thermo CO2培養(yǎng)箱;德國Leica-DFC295倒置生物顯微鏡;Airtech超凈工作臺;湘儀公司-TDZ4A-WS低速離心機。

1.3 主要試劑的配制

1%明膠,20% BSA,8mg/L嘌呤霉素,以上試劑均用PBS液配制;0.1% Ⅱ型膠原酶(含40U/ml DNase I),用M199無血清培養(yǎng)基配制;M199培養(yǎng)液(含20%胎牛血清,4000mg/L D-葡萄糖,4mmol/L L-谷氨酰胺,1.9g/L NaHCO3,20mmol/L HEPES,100mg/L肝素鈉)用超純水配制。所有試劑配制后經(jīng)0.22μm微孔濾器過濾除菌。

1.4 BMECs的原代培養(yǎng)

取4只7～10日齡SD大鼠,斷頸處死消毒后,置于超凈臺內(nèi),剪開顱骨取大腦皮質(zhì),用預冷PBS液多次漂洗,期間用滴管反復吹打以去除部分血細胞、血凝塊和軟腦膜。再將大腦皮質(zhì)剪至肉泥樣,加入4ml 20% BSA,勻漿4次,離心,收集上清液再次離心?；旌?次離心后的沉淀,滴加8ml 0.1% Ⅱ型膠原酶(含2ml 40U/ml DNaseI酶)于37℃下消化30min,離心,吸取離心管底部的微血管段沉淀,與4ml培養(yǎng)液混勻后接種于1%明膠包被的50ml培養(yǎng)瓶中,將其靜置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。其后全量換用含2mg/L 嘌呤霉素的培養(yǎng)液作用48h,之后再次改用不含嘌呤霉素的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),并每隔48h半量換液1次。

1.5 BMECs的傳代培養(yǎng)

待細胞培養(yǎng)至接近融合狀態(tài)時,吸取全部培養(yǎng)液,用37℃預熱的PBS液漂洗2遍,然后加入4ml 0.1%胰蛋白酶/0.01% EDTA混合酶溶液,室溫下消化2～3min,期間間斷性地輕微震蕩培養(yǎng)瓶,以促進細胞脫落。鏡下觀察到大部分細胞變圓、縮小,開始從瓶壁脫落時,滴加4ml培養(yǎng)液以終止消化,吹打混勻,離心,收集沉淀,按1∶2的傳代比例分瓶接種后,靜置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

于倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)、貼壁及融合度等生長狀況,并拍照記錄。

1.6 第Ⅷ因子相關抗原免疫細胞化學染色檢測

待傳代于培養(yǎng)皿中的BMECs增殖生長接近70%融合狀態(tài)時,用PBS液漂洗5min×3次,繼而滴加預冷的4%多聚甲醛,常溫固定細胞15min;PBS液漂洗5min×3次,滴加0.3% Triton X-100常溫透膜15min;PBS液漂洗5min×3次,滴加5% BSA室溫封閉20min;棄封閉液,滴加1∶300稀釋的兔抗人Ⅷ因子多克隆抗體,置于濕盒中4℃過夜;PBS液漂洗5min×3次,滴加羊抗兔二抗,37℃孵育30min;PBS液漂洗5min×3次,滴加SABC,37℃孵育30min;PBS液漂洗5min×3次,DAB室溫顯色1～2min;PBS液再次漂洗后,置于倒置顯微鏡下觀察并拍照。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學觀察

倒置顯微鏡下觀察可見： 接種于培養(yǎng)瓶中的腦微血管段呈長短不一的單枝、分枝狀,或收縮折疊成“串珠樣”(圖1A)。培養(yǎng)24～48h后可觀察到貼壁的血管段出芽生長,呈“蜈蚣蟲樣”,周圍爬出短梭形或多角形的內(nèi)皮細胞(圖1B);3d左右可見“島嶼狀”或“團簇樣”分布的細胞集落(圖1C);4～6d集落逐漸融合(圖1D-1F);7d后細胞長滿瓶底,“渦旋狀”分布,呈典型的“鋪路石樣”單層貼壁生長(圖1G)。

2.2 第Ⅷ因子免疫細胞化學染色檢測

免疫細胞化學染色檢測Ⅷ因子相關抗原蛋白表達呈陽性,陽性細胞率達99%以上。鏡下可見細胞胞質(zhì)淡染成棕黃色,胞核呈空泡狀(圖1I)。

3 討論

原代大鼠BMECs的體外分離培養(yǎng),其主要技術難點在于血管段不易獲取、活性較差以及易受雜細胞污染等[4-5]。本課題組參考國內(nèi)外相關文獻,通過反復試驗探索,有效地解決了以上問題,成功分離培養(yǎng)出大鼠BMECs。

通過本次實驗,課題組體會到： (1) 取材對象的選擇對血管段的得率及純度有較大影響。國內(nèi)學者鮑歡等[6]提出可選用1～3日齡的SD乳鼠,因其BMECs已經(jīng)分化,分裂增殖能力強,且血腦屏障的結(jié)構較薄弱,腦微血管段易于分離;而田林郁等[7]認為應選用4～6周齡的SD大鼠,因為新生鼠腦組織較少,且用其培養(yǎng)的BMECs易混入較多的雜細胞。本課題組則認為,7～10 日齡的SD大鼠腦發(fā)育未完全,血管段較易從組織中游離,同時該日齡大鼠的BMECs分裂增殖能力強,因而具有群體優(yōu)勢,且培養(yǎng)出的BMECs雜細胞較少,是良好的取材對象;(2) 較高的血管段接種密度有利于BMECs的存活與生長,因此增加單位面積內(nèi)血管段的接種數(shù)量是BMECs存活的關鍵[6]。本實驗結(jié)合許熊飛等[8]提供的方法,采用20% BSA去髓鞘,相對于15%葡聚糖而言,其分離獲得的腦微血管段數(shù)量更多,狀態(tài)更好,更容易貼壁生長;且BSA離心后收集上清液進行二次離心,顯示試管底部還有血管段沉淀,因此再次離心可獲得更多的血管段,從而增大了接種密度,有利于BMECs間生長信號的相互傳導并促進其生長;(3) 腦微血管段接種后,在合適時間段內(nèi)添加適當濃度的嘌呤霉素可有效純化目的細胞BMECs。嘌呤霉素為蛋白質(zhì)合成抑制劑,內(nèi)皮細胞因能獨特地表達多耐藥蛋白1而對嘌呤霉素具有耐藥性,其他細胞則不具有該特性,故可選用嘌呤霉素作為純化試劑。查雨鋒等[9]提出接種血管段時,添加終濃度為4mg/L的嘌呤霉素,作用48h可有效抑制雜細胞生長;而張作慧等[10]則通過實驗比較表明： 2mg/L的嘌呤霉素純化BMECs的能力與4mg/L相當,但4mg/L的嘌呤霉素會影響B(tài)MECs的增殖活力,導致細胞增殖緩慢、產(chǎn)量減少,而2mg/L嘌呤霉素則影響較小。此外,嘌呤霉素作用的時間也非常關鍵,過早加入會導致大量BMECs漂浮死亡;同時,原代BMECs在體外培養(yǎng)過程中,多耐藥蛋白1表達會降低[11],因而對嘌呤霉素的抵抗能力亦減弱。所以課題組綜合了以上嘌呤霉素的量效和時效等諸多影響因素,于接種48h后全量換用含2mg/L嘌呤霉素的培養(yǎng)液,48h后再次改用不含嘌呤霉素的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),最終免疫細胞化學顯色結(jié)果顯示,純化率可達99%以上。

圖1 BMECs的培養(yǎng)及形態(tài)學觀察與鑒定

此外,提供足夠數(shù)量的受試BMECs也是保證實驗正常開展的前提和基礎,所以筆者認為原代BMECs的傳代培養(yǎng)對于下一步實驗的開展至關重要,需重視其傳代的時機、比例以及消化酶的合理使用。在BMECs傳代的時機上,課題組選擇在細胞對數(shù)生長期進行,此時的細胞活性高,傳代后更易存活;而傳代使用的消化酶則選用濃度較低的0.1%胰蛋白酶/0.01% EDTA混合酶溶液,消化時鏡下觀察到大多數(shù)細胞變圓縮,呈流沙樣從瓶底脫落時即終止其消化,以減少胰蛋白酶對細胞的化學損傷;同時傳代的比例不宜過大,按1∶2進行,以保證細胞的接種密度,從而更有利于傳代細胞的貼壁生長。值得注意的是,BMECs的傳代次數(shù)有限,不能連續(xù)傳代[12]。如錢志遠等[13]認為體外培養(yǎng)的BMECs可傳至30代而保持其細胞生物學特性基本不變,劉愷鳴等[4,14]則認為BMECs傳至4代時,其形態(tài)及生物學特性已發(fā)生改變。本實驗結(jié)果亦顯示BMECs傳至4～5代時,就已出現(xiàn)細胞分裂增殖緩慢、融合時間延長以及胞質(zhì)中有大量空泡等老化現(xiàn)象,故宜采用4代以前的BMECs作為實驗受試細胞。

總之,本課題組在大鼠鼠齡的選擇、血管段接種的密度、細胞的純化、培養(yǎng)液的配制等方面進行了反復實踐和探索,摸索出了一種操作簡便,重復性強,可培養(yǎng)出純度高、活性好的原代BMECs培養(yǎng)方法,這亦為體外血腦屏障的建立及腦血管疾病的研究奠定了重要的細胞生物學實驗基礎。