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基于受體捕獲諾如病毒檢測方法的特異性及應(yīng)用

2018-10-10 07:33:20李慧瑩王飛王大鵬靳淼程露陽段招軍
關(guān)鍵詞:原液核酸草莓

李慧瑩 王飛 王大鵬 靳淼 程露陽 段招軍

諾如病毒(Norovirus,NoVs)屬于杯狀病毒科諾如病毒屬,是引起食源性病毒病和急性胃腸炎的主要病原體,其引起的暴發(fā)案例主要發(fā)生在療養(yǎng)院[1]、醫(yī)院、游船、學(xué)校、餐廳和其他飲食場所[2]。

NoVs主要通過糞口途徑傳播。因諾如病毒不能進(jìn)行常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng),該病毒的檢測依賴于RTPCR和RT-qPCR等分子檢測方法[3]。但這些分子檢測方法具有一定的局限性,主要體現(xiàn)在:需要專門的步驟獲得病毒基因組;無法區(qū)分?jǐn)U增模板RNA是來源于感染性病毒粒子,還是游離的病毒RNA;檢測通量低[4]。為了能夠區(qū)分檢測具有感染性的病毒粒子,研究人員建立了 Cell culture-PCR(ICCPCR),和Viability(PMA/EMA/Reagent D)RT-qPCR等RT-qPCR衍生的分子生物學(xué)檢測方法[5-6]。

組織血型抗原(Histo-blood Group Antigens,HBGAs)是人體感染NoVs的受體或輔助受體,商品化PGM包含多種類型HBGAs,可識別并特異性吸附 NoVs多種基因型[7]。 Wang 等[6]基于 HBGAs 受體可特異性捕獲NoVs的原理,以豬胃黏膜提取物(porcine gastric mucin,PGM)為介質(zhì)初步建立了原位捕獲反轉(zhuǎn)錄實(shí)時定量PCR感染性NoVs的檢測方法[6]。 周震寰等[8]以 ISC-RT-qPCR 評估杜蘭病毒(Tulane virus,TV)和NoVs的滅活效率,并將其應(yīng)用于市售貝類樣品中NoVs的檢測[8]。ISC-RT-qPCR具有特異性強(qiáng),可批量檢測,無需核酸提取復(fù)雜操作和無PCR抑制劑等優(yōu)點(diǎn)[6,8]。

生鮮食品為諾如病毒食源性暴發(fā)的主要載體[9]。由于漿果類食品酸性較強(qiáng),含有各種檢測抑制劑,污染的病毒含量低等因素,使得食源性病毒檢測成為全球公共衛(wèi)生面臨的重點(diǎn)和難點(diǎn)[10]。為了驗(yàn)證ISC-RT-qPCR方法是否可以用于漿果類污染NoVs的檢測,本研究針對ISC-RT-qPCR方法進(jìn)行了檢測特異性評估,并以該方法對人工污染草莓進(jìn)行NoV檢測。

1 材料與方法

1.1 材料 諾如病毒陽性糞便NoVs GⅡ型(GⅡ3、GⅡ4、GⅡ6、GⅡ12、GⅡ13、GⅡ17、GⅡ21 和 GⅡ22)由中國疾病預(yù)防控制中心病毒病所病毒性腹瀉室保存;豬胃黏膜蛋白(PGM)由美國農(nóng)業(yè)部西部研究中心PengTian博士惠贈;草莓購自于北京市昌平區(qū)水果菜市場。HBSS稀釋液(Gibica);0.05%TBST緩沖液(0.05%Tween20);1%BSA;TGBE洗脫液(0.1 mol/L Tris-HCl,0.05 mol/L Glycine,3%Beef Extract,PH9.5); 果 膠 酶(Sigma); PEG6000(Sigma);病毒RNA提取試劑盒(Geneaid);One step qRT-PCR probe kit(南京諾唯贊生物科技有限公司)。

1.2 儀器與設(shè)備 ABI Prism?7500型熒光定量PCR儀(ABI);高速冷凍離心機(jī)(Hitachi);水平搖床(北京六一);臺式高速冷凍離心機(jī)(Thermo Fisher Scientific);電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司);微孔板快速振蕩器(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);酶標(biāo)板條(Nunc);熒光定量封板膜(ABI)。

1.3 諾如病毒原液的制備 取諾如病毒陽性糞便標(biāo)本約0.1 g,按照1∶9的比例加入0.9 ml HBSS(1×)稀釋液稀釋諾如病毒糞便標(biāo)本,渦旋劇烈震蕩直至樣本呈均質(zhì)化狀態(tài),4℃,7 000×g離心10 min后仔細(xì)吸取上清液,作為病毒原液。提取病毒核酸確定病毒基因載量,并將其作為接種病毒原液,200 μl分裝,-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 ISC-RT-qPCR檢測NoVs 按照周震寰等發(fā)表的參考文獻(xiàn)進(jìn)行操作[8]。主要步驟為:取100 μl包被液(1.0 mg/ml PGM)添加到酶標(biāo)孔內(nèi),4℃靜置包被過夜。取出酶標(biāo)板,將包被液倒盡,將終濃度為1%的BSA添加到酶標(biāo)孔內(nèi),37℃恒溫孵育封閉1 h。取出酶標(biāo)板,將封閉液倒盡,加入200 μl PBS緩沖液清洗酶標(biāo)孔3次,倒盡液體。將100 μl NoV樣本分別加入到酶標(biāo)孔內(nèi),37℃恒溫孵育1 h。將孔內(nèi)液體吸出,加入200 μl 0.05%TBST緩沖液清洗酶標(biāo)孔3次,于每孔中添加9.5 μl DEPC水,并以聚烯烴膜封蓋,95℃高溫?zé)崃呀? min,4℃冷卻。RT-qPCR:酶標(biāo)板短暫離心,將其全部的核酸轉(zhuǎn)移到已裝有反應(yīng)體系(具體成分比例見3.4)的 PCR八聯(lián)排管中,并混合均勻?;靹蚝蟀凑誖T-qPCR擴(kuò)增條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.5 ISC-RT-qPCR檢測新鮮草莓中NoVs 稱取10 g新鮮草莓,在生物安全柜中點(diǎn)滴接種100 μl NoV原液于草莓表面,4℃孵育30 min;小心把模擬樣品轉(zhuǎn)移到100 ml錐形瓶中,加入30U果膠酶,再加入30 ml TGBE洗脫液(pH9.5),放置搖床100 r/min搖洗30 min;收集全部含有NoV洗脫液至50 ml高速離心管中,4℃、10 000×g離心15 min后取上清液,調(diào)節(jié)pH值至7.0~7.4。使用終濃度為10%PEG6000/0.3 mol/L NaCl沉淀富集上清液中的NoV,4℃搖轉(zhuǎn)1 h。4℃、10 000×g離心45 min,棄上清保留沉淀,200 μl PBS重懸沉淀。加等體積的氯仿∶丁醇(1∶1)渦旋 10 s,靜置 5 min,4 ℃、10 000×g離心15 min,取上清100 μl,添加到已包被好的酶標(biāo)孔內(nèi)。ISC-RT-qPCR檢測回收液和接種原液中NoV。

1.6 RT-qPCR擴(kuò)增

1.6.1 病毒核酸提取:按照Viral Nucleic Acid Extraction KitⅡ說明書提取病毒RNA。100 μl的糞便懸液樣品進(jìn)行病毒核酸純化,最終以50 μl洗脫液進(jìn)行核酸洗脫。10 μl分裝,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2 RT-qPCR:實(shí)時熒光RT-PCR反應(yīng)體系總體積為 25 μl,包括 2 × One-step Q probe Mix12.5 μl,50 × ROX Reference Dye2、上下游引物(10 μmol/L)各 0.5 μl,探針(10 μmol/L)0.25 μl,One-step Q probe enzyme Mix1.25 μl,其余 9.5 μl,包括 2.5 μl的模板和7 μl DEPC水(ISC-RT-qPCR的體系中9.5 μl均為模板核酸)。擴(kuò)增條件為:50℃ 15 min;95℃ 30 s;[95 ℃ 10 s;60 ℃ 40 s],45 個循環(huán)。 Ct值是按照是每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)計(jì)算。用已知拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線,確定接種原液中NoVs的基因拷貝數(shù),NoVGⅡ的擴(kuò)增效率為102%。

2 結(jié)果

2.1 ISC-RT-qPCR檢測NoVs不同基因型別的特異性 我們篩選 NoVGⅡ型(GⅡ3、GⅡ4、GⅡ6、GⅡ12、GⅡ13、GⅡ17、GⅡ21 和 GⅡ22)陽性臨床腹瀉樣本,評價ISC-RT-qPCR檢測NoVs不同基因型別的特異性。結(jié)果見表1,ISC-RT-qPCR檢測NoV GⅡ3、GⅡ4、GⅡ6、GⅡ12、GⅡ13、GⅡ17、GⅡ21 和 GⅡ22 的 Ct值分別為 34.87、35.56、31.78、28.39、30.88、34.78、36.19 和36.77。 NoVGⅡ3、GⅡ4、GⅡ6、GⅡ12基因型的ISC-RT-qPCR檢測的Ct值大于傳統(tǒng)RT-qPCR檢測 Ct值;而 NoVGⅡ13、GⅡ17、GⅡ21和GⅡ22基因型ISC-RT-qPCR檢測的Ct值小于傳統(tǒng)RT-qPCR檢測的Ct值。

表1 傳統(tǒng)RT-PCR和ISC-RT-qPCR檢測諾如病毒不同基因型別代表株Tab.1 Representative strains of NoV were detected with ISC-RT-qPCR and conventional RT-PCR

2.2 ISC-RT-qPCR檢測不同 將已篩選確認(rèn)NoVGⅡ基因型陽性且NoV載量含量高的臨床腹瀉樣本的便懸液用HBSS緩沖液10倍梯度稀釋到10-4倍,包括 NoVGⅡ3、GⅡ4、GⅡ6 和 GⅡ12 基因型。ISC-RT-qPCR檢測結(jié)果見圖1。無論是NoV GⅡ3、GⅡ4、GⅡ6和GⅡ12,傳統(tǒng)RT-PCR檢測的 Ct值隨著稀釋倍數(shù)的增加而呈線性增加,而ISC-RT-qPCR檢測的Ct值并沒有隨著稀釋倍數(shù)的增加而變化。并且當(dāng)梯度稀釋到10-3倍和10-4倍時ISC-RT-qPCR檢測的Ct值小于傳統(tǒng)RT-PCR檢測的Ct值。

圖1 比較傳統(tǒng)RT-qPCR和ISC-RT-qPCR檢測不同濃度NoVGⅡ基因型臨床腹瀉標(biāo)本Note:Horizontal axis shows the dilution ratio,tenfold serial dilutions(10-1,10-2,10-3and 10-4),and the vertical axis shows Ct value.The gray solid square indicate the Ct value(the average of three repeated detections)using ISC-RT-qPCR;the black solid diamond indicate the Ct value(the average of three repeated detections)using RT-qPCRFig.1 Comparison of detection results on clinical diarrhea samples with various inoculum of NoV GⅡusing RT-qPCR and ISC-RT-qPCR

2.3 ISC-RT-qPCR檢測草莓中NoV的效果 在10 g鮮草莓中接種100 μl不同濃度NoVGⅡ型陽性臨床腹瀉樣本便懸液,TGBE洗液洗脫,終濃度10%PEG6000/0.3 mol/LNaCl富集后,用 ISC-RT-qPCR檢測回收液中NoV,用傳統(tǒng)RT-qPCR檢測接種原液的NoV。結(jié)果表明(見表2),隨著接種NoV濃度的降低,用傳統(tǒng)RT-qPCR檢測方法檢測接種原液NoV所得到的Ct值在線性上升,當(dāng)接種原液NoV總濃度達(dá)到102基因拷貝數(shù)以下,達(dá)到了該方法的檢測限。而用ISC-RT-qPCR檢測草莓回收液中NoV,得到的Ct值在33.98~41.17之間。當(dāng)接種原液NoV濃度為1.36基因拷貝數(shù)/10 g時,ISC-RT-qPCR檢測Ct值為38.78。說明ISC-RT-qPCR檢測草莓中NoV GⅡ的檢測限可達(dá)到1.36基因拷貝數(shù)/10 g。

表2 ISC-RT-qPCR檢測不同梯度諾如病毒Tab.2 The effect of detection of viral quantity by ISC-RT-qPCR

3 討論

近幾年,全球范圍內(nèi)食源性諾如病毒暴發(fā)頻繁被報道,該病毒已造成了嚴(yán)重的公共健康負(fù)擔(dān)。為更好的對病毒疫情進(jìn)行控制,及對患者進(jìn)行準(zhǔn)確診斷治療,建立高效而靈敏的NoVs檢測方法顯得尤為重要。因NoVs不能進(jìn)行常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng),目前分子生物學(xué)技術(shù)是檢測NoVs的主要手段,其中RT-qPCR因其準(zhǔn)確性強(qiáng)、特異性好和靈敏度高等特點(diǎn)被公認(rèn)為 NoVs檢測的金標(biāo)準(zhǔn)[11]。但是傳統(tǒng) RT-qPCR無法區(qū)分檢測信號是來源于完整的病毒顆粒還是游離的 RNA[12]。為盡可能的達(dá)到區(qū)分的目的,建立了RT-qPCR衍生的分子生物學(xué)檢測方法[6]。ISC-RT-qPCR是衍生技術(shù)的主要代表,該方法基于HBGAs受體捕獲病毒的原理,即以NoVs受體HBGAs為介質(zhì)特異性吸附病毒顆粒,熱裂解釋放核酸后,再對病毒核酸進(jìn)行實(shí)時定量檢測,從而達(dá)到區(qū)分感染性 NoVs的目的[6]。 目前,ISC-RT-qPCR僅被應(yīng)用于市售貝類樣品NoV檢測[8]。本研究進(jìn)一步探討ISC-RT-qPCR檢測GⅡ組NoVs不同基因型的特異性,并評估其在新鮮草莓中NoV的檢測效果。

Tian等對豬胃黏蛋白偶聯(lián)磁珠(Porcine Gastric mucin-conjugated magnetic beads,PGM-MB)捕獲不同NoV GⅡ基因型的特異性和動力學(xué)研究報道稱,85%NoVGⅡ基因型(GⅡ1a/1b/1c/1 d、GⅡ4 Farmington/Hunter-like/sample B、GⅡ5、GⅡ7、GⅡ11和GⅡ12)成功地被 PGM-MB捕獲并濃縮,僅NoVGⅡ4 Bristol和NoVGⅡ6基因型沒有得到理想的濃縮效果[7]。本研究篩選了除Tian選用的NoVGⅡ4和GⅡ12基因型外,還對NoV GⅡ3、GⅡ13、GⅡ16、GⅡ17、GⅡ21和 GⅡ22基因型進(jìn)行 ISC-RT-qPCR檢測,并且成功的在臨床腹瀉標(biāo)本中檢測到以上NoV基因型信號。

在本研究中,當(dāng)臨床腹瀉樣本中NoVs的基因載量相對高時,ISC-RT-qPCR檢測的Ct值高于傳統(tǒng)RT-qPCR的Ct值;而當(dāng)臨床腹瀉樣本中NoVs的基因載量相對低時,ISC-RT-qPCR檢測的Ct值低于傳統(tǒng)RT-qPCR的Ct值。同時也發(fā)現(xiàn),之前 ISC-RT-qPCR檢測的Ct值高于傳統(tǒng)RT-qPCR的Ct值的臨床腹瀉樣本(NoVGⅡ3、NoV GⅡ4、NoV GⅡ6和NoV GⅡ12基因型)隨著稀釋倍數(shù)增加到10-3倍后,ISC-RT-qPCR檢測得到的Ct值低于傳統(tǒng)RT-qPCR的Ct值。說明ISC-RT-qPCR在檢測NoV載量低的臨床腹瀉樣本的靈敏度高于傳統(tǒng)RT-qPCR。ISC-RT-qPCR使用的是包被在一定表面積的酶標(biāo)板孔上的1 mg/ml PGM捕獲病毒粒子,王大鵬等已確認(rèn)1 mg/mL PGM是避免過量低效的最佳濃度[8],那么“有限的酶標(biāo)孔表面積僅能提供一定量NoV結(jié)合位點(diǎn)”這一特點(diǎn),將使得ISC-RT-qPCR方法有一個結(jié)合NoVs的飽和值。當(dāng)待檢樣品中NoVs的載量大于該飽和值時,ISC-RT-qPCR檢測所得的Ct值將不會像傳統(tǒng)RT-qPCR那樣隨著NoVs的載量的增加而Ct值線性降低,反而高于RT-qPCR的Ct值。

目前草莓中諾如病毒檢測主要分為兩個步驟,包括病毒的分離和RT-qPCR核酸檢測。用堿性洗脫液洗脫和PEG沉淀獲得病毒,其檢測限可達(dá)到102RT-PCRU/10 g,回收率在 2% ~ 44% 之間[3];用堿性洗脫液洗脫和超濾的方法被報道的很少,但檢測限可達(dá)到54 RT-PCRU/15g[13]。本研究采用堿性洗脫液洗脫和PEG沉淀,再結(jié)合ISC-RT-qPCR檢測草莓中NoV,其檢測限可達(dá)到1.36基因拷貝數(shù)/10 g,低于以往的研究報道。無論是PEG沉淀、超濾還是超速離心均將30~50 ml洗脫液濃縮到30 μl~50 μl之間。 而本研究100 μl濃縮液通過 PGM 捕獲后最終的濃縮體積降低到9.5 μl。也就是與傳統(tǒng)的方法相比,ISC-RT-qPCR方法可以達(dá)到進(jìn)一步濃縮的效果。另外,草莓的成分復(fù)雜,含有多種PCR抑制劑,有研究利用氯仿丁醇去除PCR抑制劑[14],但氯仿具有刺激性氣味和劇毒。本研究通過PGM捕獲病毒后,沖洗掉其他的遺留成分,不用添加任何試劑,便有效去除了PCR抑制劑對檢測影響。

綜上所述,ISC-RT-qPCR能特異性檢測不同的諾如病毒GⅡ基因型,尤其是在對低濃度NoV的檢測,無論是臨床樣本還是草莓樣本,都要比傳統(tǒng)RTPCR更靈敏。表明ISC-RT-qPCR是一種可用于臨床腹瀉樣本和草莓中GⅡ組感染性諾如病毒的檢測方法。

利益沖突:無

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