王傳林

北京大學(xué)人民醫(yī)院急診科

狂犬病(rabies)又稱恐水病(hydrophobia),是一種典型的人畜共患性傳染病?？袢〖瓤筛腥炯倚?又可感染野生動(dòng)物,然后通過(guò)咬傷或抓傷(通常是經(jīng)由唾液)傳播至人［1］?？袢∫话銤摲鼛滋熘翈讉€(gè)月,病毒首先感染外周神經(jīng),通過(guò)脊髓索感染腦部中樞神經(jīng),從而引發(fā)致命性的腦炎和脊髓炎,被感染人或動(dòng)物就會(huì)面臨死亡［1］。一旦發(fā)病,病死率幾乎達(dá)100%［1］。從全球范圍來(lái)看,狂犬病死亡病例絕大多數(shù)發(fā)生在非洲和亞洲,但是狂犬病除了南極洲,其他各大洲都存在［2］?？袢∈且环N被忽視的熱帶疾病,主要影響偏遠(yuǎn)農(nóng)村地區(qū)的貧困和脆弱人群［2］。在全球范圍內(nèi),每年有數(shù)萬(wàn)人死于狂犬病,每10名受到疑似狂犬咬傷的人員中有4名為15歲以下兒童。每10 min就有1人死于狂犬病,亞洲和非洲的醫(yī)療負(fù)擔(dān)最重［2］。目前,非洲和亞洲的貧窮農(nóng)村地區(qū)約80%的狂犬病暴露者無(wú)法得到及時(shí)治療,提供經(jīng)濟(jì)實(shí)惠、優(yōu)質(zhì)的疫苗和有效的狂犬病免疫球蛋白,是實(shí)現(xiàn)狂犬病零死亡的關(guān)鍵所在［2］。

1 人用狂犬病疫苗的種類

130多年來(lái),狂犬病疫苗的種類主要體現(xiàn)在神經(jīng)組織類疫苗、非神經(jīng)組織疫苗［3］,見(jiàn)表1。中國(guó)目前批準(zhǔn)上市應(yīng)用的人用狂犬病疫苗均為細(xì)胞培養(yǎng)疫苗［3］,見(jiàn)表 2。

2 神經(jīng)組織類疫苗

2.1 巴斯德疫苗 狂犬病疫苗的研制始于1882年,法國(guó)路易斯.巴斯德制備疫苗的方法是用連續(xù)傳代的方法減弱病毒的毒力［4］。1885年,路易斯.巴斯德對(duì)1名被瘋狗嚴(yán)重咬傷的男孩進(jìn)行了暴露后處理,這是被咬傷的患者第一次采用疫苗來(lái)治療,對(duì)人類預(yù)防狂犬病具有劃時(shí)代的意義［4］。目前,人類依然將路易斯.巴斯德創(chuàng)立的街毒與固定毒理論作為經(jīng)典［4］。此后,各國(guó)遵循著巴斯德確定的原則與方向?qū)袢∫呙绮粩嗟馗倪M(jìn)。

表1 人用狂犬病疫苗類型及特征Tab.1 Types and characteristics of human rabies vaccine

表2 中國(guó)目前批準(zhǔn)上市應(yīng)用的人用狂犬病疫苗種類Tab.2 Species of human rabies vaccine approved and marketed in China

2.2 山氏疫苗 英國(guó)人Semple在1911年通過(guò)用0.5%～1.0%酚滅活,從而制備的滅活病毒疫苗［5］。該疫苗主要使用地在亞洲和非洲,只用作暴露后注射［5］。不過(guò)用該疫苗接種針次一般14～21針,接種后人體異常反應(yīng)嚴(yán)重,由于其含有高含量的髓鞘成分,在個(gè)例中會(huì)發(fā)生致命的腦炎［6］。

2.3 弗氏疫苗 1956年研究者在乳鼠腦組織接種狂犬病病毒,制備乳鼠腦組織狂犬病疫苗也叫弗氏疫苗［7］。在過(guò)去50多年中,此疫苗廣泛應(yīng)用于南美洲［7］。20世紀(jì)60年代,前蘇聯(lián)成功制備乳大白鼠腦組織疫苗,但隨后委內(nèi)瑞拉發(fā)生11例與鼠腦狂犬病疫苗相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥患者［8］。

神經(jīng)組織疫苗有諸多缺點(diǎn):接種次數(shù)高達(dá)14針、每針2 ml、產(chǎn)生抗體水平低、速度慢,還易殘留活病毒,易引發(fā)變態(tài)反應(yīng),因此WHO已提出盡快停止使用該類疫苗、改用新型細(xì)胞培養(yǎng)疫苗的建議［8］。

3 非神經(jīng)組織類疫苗

3.1 禽胚疫苗 1956年研究者將狂犬病病毒株接種至7日齡鴨胚卵黃囊,培養(yǎng)2周左右,然后將胚胎細(xì)胞磨碎,最后制成懸液后滅活［9］。1959年,Powell等提升了鴨胚疫苗的質(zhì)量工藝,通過(guò)用10%的β-丙內(nèi)酯滅活而獲得狂犬病疫苗［7］。20世紀(jì)80年代,歐美發(fā)達(dá)國(guó)家不再生產(chǎn)和使用鴨胚疫苗,不過(guò)對(duì)于禽胚胎制備狂犬病疫苗一直在持續(xù)研究,隨著技術(shù)工藝的提升,通過(guò)采用化學(xué)提取和區(qū)帶離心技術(shù),可制備出高度純化的鴨胚疫苗,其不良反應(yīng)少、免疫效果好,臨床應(yīng)用多年,目前在亞洲、非洲和南美洲一些國(guó)家使用［10］。

3.2 細(xì)胞類疫苗 由于神經(jīng)組織疫苗、禽胚疫苗接種反應(yīng)大、免疫效果不佳,為了提高狂犬病疫苗的效果、優(yōu)化免疫程序和降低異常反應(yīng)發(fā)生率,1960年后,研究者開(kāi)始嘗試用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)來(lái)研發(fā)狂犬病疫苗［11］。

3.2.1 原代地鼠腎細(xì)胞疫苗:加拿大Kissling于1958年首先用地鼠腎細(xì)胞培養(yǎng)狂犬病病毒制備滅活疫苗；1966年前蘇聯(lián)用地鼠腎細(xì)胞培養(yǎng)Vnukovo32株制備原代地鼠腎細(xì)胞狂犬病疫苗(primary hamster kidney cell rabies vaccine,PHKCV),該疫苗應(yīng)用于東歐的大部分國(guó)家和前蘇聯(lián)；1968年加拿大批準(zhǔn)暴露前和加強(qiáng)免疫可用PHKCV［7］。隨后經(jīng)大量臨床研究證實(shí)人群接種PHKCV是安全有效的［7］。

國(guó)內(nèi)由中國(guó)衛(wèi)生部武漢生物制品研究所牽頭,中國(guó)藥品生物制品檢定所等單位合作,從1965年開(kāi)始,經(jīng)過(guò)多年的研究培育出aG株,最終于1979年研制成功并獲準(zhǔn)生產(chǎn)PHKCV,該疫苗的安全性和免疫性高,可用于狂犬病的預(yù)防和治療［12］。

3.2.2 純化雞胚細(xì)胞疫苗:日本于1965年將狂犬病病毒Flury-LEP株在雞胚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)制備狂犬病疫苗［13］。德國(guó)于1983年也成功制得該疫苗,通過(guò)采用Flury-LEP株接種雞胚成纖維細(xì)胞,通過(guò)β-丙內(nèi)酯滅活精制成濃縮疫苗,Novartis(Chiron Behring,德國(guó))制造的純化雞胚細(xì)胞狂犬病疫苗(purified chick embryo cell rabies vaccine,PCECV)經(jīng)試驗(yàn)評(píng)估性能優(yōu)良［14］。目前,PCECV在全球范圍內(nèi)有超過(guò)20個(gè)國(guó)家可實(shí)施生產(chǎn),美國(guó)食品藥品管理局在1997年批準(zhǔn)PCECV疫苗上市［15］。PCECV暴露后預(yù)防的中和抗體幾何平均滴度約為4 IU/ml,只有0.9%的研究對(duì)象中和抗體幾何平均滴度低于1 IU/ml,具有良好的免疫原性［15］。此疫苗生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單,不良反應(yīng)較輕微、病毒滴度高,因而受到WHO 推薦［15］。

3.2.3 純化Vero細(xì)胞疫苗:在滿足狂犬疫苗規(guī)?；a(chǎn)需求方面,傳代細(xì)胞起著重要作用,有代表性的傳代細(xì)胞為Vero細(xì)胞。傳代細(xì)胞會(huì)附著在生物反應(yīng)器中的微載體表面生長(zhǎng),同時(shí)可以通過(guò)胰蛋白酶進(jìn)行消化,進(jìn)行傳代和轉(zhuǎn)移,這種技術(shù)大大降低了生產(chǎn)成本,從而制得純化 Vero細(xì)胞狂犬病疫苗(purified vero cell rabies vaccine,PVRV)［16］。 在世界范圍內(nèi),科學(xué)家希望通過(guò)Vero細(xì)胞生產(chǎn)出低成本疫苗,并希望達(dá)到或超過(guò)人二倍體細(xì)胞狂犬病疫苗(human diploid cell rabies vaccine,HDCV)的安全性和有效性水平。

法國(guó)Merieux研究所于1984年以Vero細(xì)胞貼附在微載體懸浮培養(yǎng),成功研制PVRV。PVRV在歐洲和很多發(fā)展中國(guó)家獲得批準(zhǔn)［16］。由于Vero細(xì)胞培養(yǎng)的狂犬病病毒產(chǎn)量高、價(jià)格低、免疫效果好,1987年WHO頒發(fā)了Vero細(xì)胞生產(chǎn)人用純化狂犬病滅活疫苗規(guī)程,推薦使用 Vero細(xì)胞生產(chǎn)的狂犬病疫苗［16］。目前PVRV在全世界范圍都有使用,也是國(guó)內(nèi)產(chǎn)量最大,應(yīng)用最廣泛的人用狂犬病疫苗［17］。

3.2.4 金黃地鼠腎細(xì)胞(BHK-21)疫苗:BHK-21細(xì)胞可以在生物反應(yīng)器內(nèi)大規(guī)模培養(yǎng)。有文獻(xiàn)報(bào)道將狂犬病病毒Flury-LEP株接種BHK-21細(xì)胞制備滅活狂犬病疫苗用于獸用［18］。法國(guó)巴斯德研究所采用生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)BHK-21細(xì)胞制備狂犬病疫苗,該疫苗在小鼠體內(nèi)獲得了滿意的保護(hù)效果［19］。進(jìn)一步使用BHK-21細(xì)胞狂犬病疫苗在人類志愿者中進(jìn)行初步試驗(yàn),證實(shí)該疫苗有良好的免疫原性和耐受性［19］。 BHK-21 細(xì)胞本身是致瘤的,但以 β-丙內(nèi)酯(病毒滅活的濃度)處理即可去掉致瘤性。另外,通過(guò)純化技術(shù)可使殘余的細(xì)胞DNA量最小化,并符合質(zhì)量要求［19］。

3.2.5 人二倍體細(xì)胞疫苗:美國(guó)Wistar研究所于1964年使用人二倍體細(xì)胞WI-38株適應(yīng)狂犬病病毒Pitman-Moore(PM)株制備狂犬病疫苗［20］。法國(guó)Merieux研究所于1974年獲準(zhǔn)生產(chǎn)HDCV,所用細(xì)胞系為人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5；1976年,HDCV首先在歐洲獲得批準(zhǔn)用于暴露前和暴露后免疫,1978年開(kāi)始商品化［20］。HDCV在美國(guó)1980年獲得批準(zhǔn)上市,并且5年的臨床研究表明,HDCV疫苗預(yù)防狂犬病100%成功［20］。也有研究者采用恒河猴二倍體細(xì)胞培養(yǎng)狂犬病疫苗,然后加入磷酸鋁作為佐劑,其臨床應(yīng)用推廣還需進(jìn)一步研究,與HDCV相比,其安全性還有待驗(yàn)證［21］。

將HDCV疫苗在4℃和37℃放置1個(gè)月后,采用NIH法檢測(cè)疫苗效價(jià),發(fā)現(xiàn)二者無(wú)明顯差異,說(shuō)明該疫苗具備良好的穩(wěn)定性［22-23］。也有研究將5批效價(jià)為4.3～5.6的疫苗4℃存放3.5年后進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示所有疫苗效價(jià)均在保護(hù)水平之上［22-23］。研究顯示HDCV免疫后1個(gè)月或3個(gè)月中和抗體達(dá)峰值(10 IU/ml左右),隨后逐漸降低,但2年內(nèi)始終在保護(hù)水平之上,加強(qiáng)免疫后,中和抗體滴度迅速增加10～15倍,肌內(nèi)注射和皮下注射途徑臨床效果相近［22-23］。

人二倍體細(xì)胞為正常核型細(xì)胞,無(wú)致癌性,HDCV無(wú)任何外源動(dòng)物雜質(zhì)及神經(jīng)毒性因子,注射針次少,不良反應(yīng)輕,安全有效,被WHO認(rèn)為“近乎理想的人用疫苗”,是目前公認(rèn)的金標(biāo)準(zhǔn)狂犬病疫苗,常作為新研發(fā)狂犬病疫苗的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照疫苗［24］。HDCV的缺點(diǎn)是人二倍體細(xì)胞培養(yǎng)難度大,病毒滴度較低,從而導(dǎo)致產(chǎn)能低、生產(chǎn)成本高、終端價(jià)格昂貴［24］。在美國(guó),HDCV暴露后免疫費(fèi)用達(dá)1 000多美元；而在巴基斯坦,用山氏疫苗進(jìn)行暴露后免疫只需2.5美元,這樣在發(fā)展中國(guó)家是無(wú)法實(shí)現(xiàn)HDCV推廣的［24］。

美國(guó)Wistar研究所首創(chuàng)的HDCV金標(biāo)準(zhǔn)疫苗是人二倍體細(xì)胞培養(yǎng)上清的超濾濃縮產(chǎn)物,雖然免疫原性和安全性良好,但是對(duì)于免疫低下人群偶爾還會(huì)引起不良反應(yīng)［25］。2014年上市的國(guó)產(chǎn)HDCV采用了生物反應(yīng)器微載體培養(yǎng)技術(shù)、超濾濃縮和層析純化技術(shù),疫苗質(zhì)量指標(biāo)突出,免疫原性和安全性好,改變了我國(guó)沒(méi)有金標(biāo)準(zhǔn)狂犬病疫苗的局面［26］。

4 研制中的疫苗

重組疫苗、植物來(lái)源疫苗、DNA疫苗、多肽疫苗、亞單位疫苗等新型狂犬病疫苗正處于研發(fā)階段［27］。重組疫苗中最主要的是復(fù)制缺陷型痘病毒、復(fù)制缺陷型腺病毒以及非致病性彈狀病毒狂犬病疫苗［28］。以金絲雀痘病毒為載體制備的狂犬病疫苗進(jìn)行的Ⅰ期臨床試驗(yàn)表明,接種后均可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體,是很有潛力的人用狂犬病疫苗［29-30］。馬鈴薯、苜?；?、煙草等多種植物已經(jīng)可用于生產(chǎn)狂犬病病毒抗原,但是研究尚處于早期階段［31-32］。DNA狂犬病疫苗有基因突變風(fēng)險(xiǎn),人用比較危險(xiǎn),科學(xué)家于1994年已成功構(gòu)建DNA狂犬病疫苗,對(duì)小鼠進(jìn)行免疫并產(chǎn)生中和抗體［33］。亞單位狂犬病疫苗是通過(guò)提取狂犬病病毒糖蛋白來(lái)制備疫苗,包括糖蛋白亞單位疫苗、核糖核酸蛋白亞單位疫苗(RNP)和重組核酸蛋白亞單位疫苗［34-35］。1982年,研究報(bào)道可將狂犬病病毒糖蛋白裂解成7個(gè)大小不等的多肽片段,進(jìn)而刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體,并可激活T淋巴細(xì)胞,這是多肽狂犬病疫苗僅有的進(jìn)展［36］。研究報(bào)道免疫復(fù)合物亞單位疫苗可克服多肽疫苗免疫原性差的缺點(diǎn),免疫小鼠和狗,產(chǎn)生的中和抗體滴度較高［36］。

5 展望

狂犬病治療存在的困難是如何治療已處于狂犬病發(fā)病期的患者。哺乳動(dòng)物宿主腦部能夠產(chǎn)生對(duì)狂犬病病毒固有的免疫反應(yīng),但病毒磷蛋白的拮抗抑制,會(huì)使狂犬病病毒在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中繁殖,進(jìn)而使宿主本身的適應(yīng)性免疫和固有免疫無(wú)法成功,宿主將會(huì)面臨死亡。一種治療方式是通過(guò)對(duì)狂犬病病毒的基因序列進(jìn)行定點(diǎn)修飾,將修飾后的毒株對(duì)機(jī)體進(jìn)行接種,進(jìn)而降低感染,這是治療性狂犬病疫苗的雛形［36-37］。

狂犬病疫苗的發(fā)展本質(zhì)是分子生物學(xué)的發(fā)展,伴隨制備工藝的提升,狂犬病疫苗的品質(zhì)逐漸提升［36］。任何已知的新型狂犬病疫苗研究目前并未進(jìn)入臨床驗(yàn)證階段,但是這些探索性的努力都為實(shí)現(xiàn)“到2030年人類狂犬病零死亡”提供了更大的可能性［36］。

利益沖突:無(wú)