蕪為 劉洋 張全福 李川 梁米芳 李建東 李德新

近年來,隨著中非友誼的不斷加深,中非間的經(jīng)貿(mào)往來也不斷增多。尤其是“一帶一路”戰(zhàn)略將中非間的交往推向了一個新的高度。但這同樣帶來了諸多公共衛(wèi)生方面的問題,很多流行于非洲大陸的傳染病也會趁機流入我國,這其中就有不少與病毒性出血熱相關(guān)的疾病,例如埃博拉出血熱、拉沙熱、克里米亞剛果出血熱、裂谷熱、黃熱等［1］。2016年,各有11例黃熱病例和1例裂谷熱病例從非洲輸入我國。這就要求相關(guān)單位采取積極的應(yīng)對措施,包括開發(fā)有效的實驗室檢測試劑。

Luminex多重懸浮芯片檢測技術(shù)作為標準化的高通量檢測平臺,可實現(xiàn)同時快速檢測100種靶標,敏感度高,特異度強,樣本用量少,目前已應(yīng)用于多個領(lǐng)域,如細胞因子檢測［2］,感染性疾病檢測［3］,抗體和疫苗的研發(fā)［4］,核苷酸多態(tài)性分析［5］等。 本研究首次將Luminex多重檢測技術(shù)應(yīng)用于非洲流行的病毒性出血熱血清學(xué)的檢測,這些病毒主要包括克里米亞剛果出血熱病毒(CCHFV)、裂谷熱病毒(RVFV)、拉沙熱病毒(LASV)、盧約病毒(LUJV)、埃博拉病毒(EBOV)、馬爾堡病毒(MBGV)、登革熱病毒(DENV)和黃熱病毒(YFV)。初步建立了針對這些病毒抗原相應(yīng)IgG抗體的快速、敏感、高通量的特異性檢測方法,為最終實現(xiàn)鑒別診斷提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病毒基因、臨床血清樣本及動物血清 登革病毒 rEⅢ基因提取自患者血清,CCHFV、RVFV、LASV、LUJV核蛋白(NP)基因,EBOV、MBGV核蛋白基因和VP40基因,以及YFV rEⅢ基因由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。動物血清由上述基因經(jīng)原核系統(tǒng)重組表達的抗原免疫新西蘭大白兔制備。78份臨床血清樣本采自2014年埃博拉疫情暴發(fā)期間,有發(fā)熱癥狀的由非洲入境人員,但埃博拉核酸檢測均為陰性。114份陰性對照血清采自參加體檢的健康人。

1.2 出血熱病毒抗原的表達及純化 將上述8種病毒的10個基因分別克隆至pET30 a載體,并轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)感受態(tài)細胞,均勻涂布于含50 μg/ml卡那霉素抗性的固體LB培養(yǎng)基,37℃過夜培養(yǎng)后挑選出正確的克隆并接種至含50 μg/ml卡那霉素抗性的2xYT培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)至OD值達到0.6～0.8后加入IPTG至終濃度為1 mmol/L,30℃過夜培養(yǎng)。收獲細胞后用細胞裂解液重懸并超聲破碎,沉淀溶于8 mol/L尿素后過濾并經(jīng)金屬鎳離子親和層析純化,收集目的蛋白并通過透析的方法緩慢去除尿素成分,使得蛋白得以復(fù)性。純化的11種病毒抗原經(jīng)SDS-PAGE鑒定后分裝凍存于-80℃。

1.3 重組抗原與熒光微球的偶聯(lián) 熒光微球與偶聯(lián)試劑均購自伯樂公司,每種病毒抗原偶聯(lián)一種熒光微球,偶聯(lián)方法參照公司提供的方法手冊,每次將大約20 μg的重組抗原偶聯(lián)至100 μl熒光微球(1.25×106個)。偶聯(lián)前需要在微球中加入10 μl N-羥基硫代琥珀酰亞胺(Sulfo-N-hydroxysulfosucc inimide,S-NHS,50 mg/ml)和 10 μl1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(1-ethyl-3-［3-dimethylaminopropyl］carbodiimide,EDC,50 mg/ml),以活化微球的羧基端,從而與蛋白的氨基端進行共價偶聯(lián)。偶聯(lián)抗原的熒光微球可在4℃避光保存1年。

1.4 重組抗原與熒光微球偶聯(lián)效果的評價 評價每種抗原的偶聯(lián)效果使用相應(yīng)的兔血清。首先在96孔濾膜板每孔加入100 μl稀釋緩沖液(PBS＋1%BSA)預(yù)濕,真空泵抽濾；加入100 μl稀釋緩沖液和12.5 μl含相應(yīng)編碼微球的工作溶液(母液稀釋25倍,保證400個/μl,即每孔5 000個微球),真空泵抽濾；加入100 μl從1∶1 000開始4倍稀釋至1∶4 096 000的相應(yīng)兔血清,陰性對照為相同比例稀的EV71-VP1免疫兔血清?；靹蚝笫覝乇芄庹駬u1 h,稀釋緩沖液反復(fù)洗滌并抽濾3次；加入50 μl按1∶100稀釋的PE標記的羊抗兔IgG,混勻后室溫避光振搖1 h,稀釋緩沖液反復(fù)洗滌并抽濾3次；加入125 μl的稀釋緩沖液,避光振搖1 min后用Bio-Plex 200懸浮芯片儀檢測。

1.5 多重?zé)晒馕⑶驒z測臨床血清樣本 在96孔濾膜板上每孔加入100 μl的稀釋緩沖液預(yù)濕濾膜,真空泵抽濾；加入100 μl的稀釋緩沖液和12.5 μl含10種熒光微球的工作溶液,真空泵抽濾；加入100 μl以1∶1 000稀釋的血清,包括78份臨床血清和114份正常人血清?；靹蚝笫覝乇芄庹駬u1 h,稀釋緩沖液反復(fù)洗滌并抽濾3次；加入50 μl按1∶100稀釋的藻紅蛋白標記的羊抗人IgG,后續(xù)步驟參見1.4。將陰性對照的平均值加3倍標準差定義為Cutoff值。

1.6 多重?zé)晒馕⑶驒z測技術(shù)與酶聯(lián)免疫吸附法的比較 將10種出血熱病毒重組抗原分別以每孔500 ng包被于96孔ELISA板并封閉。每種板同時檢測78份臨床血清和114份正常人血清,將每份血清1∶100稀釋后加入板中,每孔加入100 μl,37℃溫育1 h。PBST洗板后加入1∶2 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗人IgG抗體,37℃溫育1 h。PBST洗板后加入TMB顯色,用酶標儀測定反應(yīng)板中每孔液體450 nm處的吸光度值(A450)。Cutoff值定義為陰性對照的平均值加3倍標準差,并將每種抗原檢測的數(shù)據(jù)與多重?zé)晒馕⑶驒z測的數(shù)據(jù)做四格表卡方檢驗,用統(tǒng)計學(xué)軟件進行兩種方法的一致性分析。

2 結(jié)果

2.1 10種出血熱病毒抗原的表達與純化 分別收集表達10種出血熱病毒抗原的菌液并超聲,上清與沉淀分別進行SDS-PAGE檢測,結(jié)果顯示目的蛋白多存在于沉淀中,為包涵體表達。經(jīng)過變復(fù)性并純化后通過SDS-PAGE鑒定,均呈現(xiàn)較單一的蛋白條帶,純度可以達到90%以上,達到檢測抗原的要求(結(jié)果未顯示)。

2.2 單重?zé)晒馕⑶驒z測兔血清評價偶聯(lián)效果 將10種病毒重組抗原分別偶聯(lián)熒光微球后,用Bio-Plex 200懸浮芯片儀單重檢測相應(yīng)的多克隆兔血清以及用于陰性對照的EV71-VP1免疫的多克隆兔血清以評價偶聯(lián)效果。檢測結(jié)果說明大部分多克隆兔血清的IgG抗體滴度基本都能達到1比100萬以上,抗原偶聯(lián)成功,而所有抗原與陰性對照EV71-VP1兔免疫血清均無明顯免疫學(xué)反應(yīng),結(jié)果未顯示。

2.3 多重?zé)晒馕⑶驒z測臨床血清樣本 將10種病毒重組抗原分別偶聯(lián)相應(yīng)的熒光微球后混合,利用懸浮芯片儀檢測了78份臨床血清和114份正常人血清IgG抗體。每種抗原均檢測了上述兩組樣本,以檢測正常人血清的平均值加3倍標準差定義為cutoff值,大于cutoff值判定為IgG抗體陽性。共檢出LASV IgG陽性1份,LUJV IgG陽性1份,DENV IgG陽性4份,YFV IgG陽性6份,其余病毒IgG抗體均未檢出。檢測結(jié)果如表1所示。

2.4 ELISA檢測臨床血清樣本并與多重?zé)晒馕⑶驒z測技術(shù)比較 將10種重組抗原分別包被ELISA板并檢測78份臨床血清和114份正常人血清樣本IgG抗體,以檢測正常人血清的平均值加3倍標準差定義為cutoff值(結(jié)果未顯示),并將ELISA檢測結(jié)果與多重?zé)晒馕⑶驒z測結(jié)果做四格表卡方檢驗進行比較并做一致性分析,結(jié)果如表2所示,可知用兩種方法檢測血清樣本中10種IgG抗體的結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義,且一致性較好。

表1 多重?zé)晒馕⑶驒z測臨床血清樣本出血熱病毒IgG抗體Tab.1 Detection of hemorrhagic fever virus IgG antibodies in clinical sera by multiplexed assay

表2 多重?zé)晒馕⑶驒z測方法與酶聯(lián)免疫吸附法檢測臨床血清的比較Tab.2 Comparison of Luminex multiplex assay and ELISA for clinical sera detection.

3 討論

本研究主要將Luminex高通量檢測方法應(yīng)用于非洲流行的病毒性出血熱IgG抗體的多重檢測。該方法相比于傳統(tǒng)的ELISA方法在血清學(xué)檢測過程中最大的優(yōu)勢在于能夠?qū)崿F(xiàn)高通量檢測,因此能夠大大節(jié)省檢測時間和樣本用量。以本實驗10重檢測為例,使用Luminex檢測方法的樣本用量為0.1 μl,2.5 h即可完成,而ELISA檢測方法需要10 μl樣本用量,至少需要6～8 h才能夠完成,并且ELISA抗原包被需要過夜,而Luminex的抗原偶聯(lián)只需要5 h［6］。除此之外,由于96孔ELISA板的底面積和側(cè)面積要比濾膜板每孔5 000個熒光微球的表面積之和大得多,從而增加非特異性的吸附并導(dǎo)致ELISA檢測結(jié)果的特異度降低。Luminex檢測方法的敏感性也要優(yōu)于ELISA方法,這是由于Luminex的熒光信號比酶的化學(xué)發(fā)光信號更加直接、穩(wěn)定和敏感,并且蛋白與微球之間以共價鍵相連,這比蛋白與ELISA板之間的疏水鍵更加穩(wěn)固、不易斷裂［7］。

目前,國內(nèi)外已建立起多種基于出血熱病毒核蛋白為檢測抗原的實驗室血清學(xué)檢測方法,如漢坦病毒(hantavirus),RVFV,發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒(SFTSV),LASV和EBOV等,并且都取得了很好的應(yīng)用效果。這主要是因為核蛋白具有很強的抗原性和免疫原性,能夠刺激機體產(chǎn)生很強的特異性體液免疫應(yīng)答和細胞免疫應(yīng)答,從而生成大量的特異性抗體可供檢測。同時,核蛋白不具有糖基化位點,且本身作為病毒主要的結(jié)構(gòu)蛋白,耐熱性和蛋白酶抗性較強,性質(zhì)較為穩(wěn)定,適合重組表達、純化和保存,是病毒性出血熱血清學(xué)診斷的首選抗原。此外,對于YFV而言,包膜糖蛋白E的結(jié)構(gòu)域Ⅲ(rEⅢ)具有較多的抗原位點,也常用于黃病毒血清學(xué)的檢測［8］。本研究中的DENV-rEⅢ是將登革病毒四個型的結(jié)構(gòu)域Ⅲ串聯(lián)在一起而形成的融合抗原,該抗原具有更好的抗原性和免疫原性,可增加檢測的敏感度。

本研究從非洲歸國的78例發(fā)熱病例中,共檢出1例LASV IgG抗體陽性,1例LUJV IgG抗體陽性,4例DENV IgG抗體陽性以及6例YFV IgG抗體陽性,并用ELISA方法進行了復(fù)核。雖然這些臨床病例均確診為瘧疾,但可以證明這些病患的既往感染史,從而間接反映出這些疾病在非洲的感染率情況。在今后的工作中,本課題組將繼續(xù)依托Luminex高通量檢測平臺,著重朝兩個方向發(fā)展:①利用IgG抗體的檢測經(jīng)驗,建立病毒性出血熱IgM抗體以及抗原的多重檢測方法；②以不同的地域為劃分,建立針對流行于當(dāng)?shù)貐^(qū)域的病毒性出血熱多重檢測方法,例如在本研究所針對的非洲地區(qū)基礎(chǔ)之上,建立流行于南美的、歐洲的或者東南亞的病毒性出血熱多重檢測方法。

綜上所述,本研究通過重組表達純化流行于非洲的出血熱病毒抗原,初步建立了基于Luminex高通量檢測平臺的針對非洲流行的病毒性出血熱IgG抗體多重檢測方法,為進一步驗證和完善該檢測方法,最終實現(xiàn)鑒別診斷奠定了基礎(chǔ)。

利益沖突:無