李潔 杜軼威 霍達 楊揚 梁志超 賈蕾 陳麗娟 王全意

腸道病毒A71型(EV-A71)具有高度的嗜神經性,感染的病例易出現神經系統(tǒng)癥狀及并發(fā)癥,甚至引起死亡［1］。2010—2012年我國實驗室確診的重癥病例80%以上由于感染EV-A71所致,手足口死亡病例中有93%以上由EV-A71感染導致［2］。推測EV-A71感染后相關臨床癥狀的差異可能是由于病毒毒力的差異導致。本研究將基于輕癥和死亡病例的C4a基因型EV-A71分別從5′UTR區(qū)核苷酸及編碼蛋白區(qū)氨基酸位點進行比較分析,探索研究與重癥死亡相關的毒力位點。

1 材料與方法

1.1 材料來源 本研究共對2個來源于咽拭子的EV-A71毒株進行基因組測序,其中1株來源于僅有出疹的輕癥手足口病例,1株來源于手足口病死亡病例。此外本研究從GenBank上下載EV-A71基因組序列用于分析。為確保各個序列間具有可比性,僅選用C4a基因型毒株的全基因組序列。為排除由于重癥病例診斷標準不同而引起分析結果的偏倚,選用了EV-A71感染導致死亡的基因組序列和輕癥的基因組序列。序列入選標準是:在時間、地理位置上接近的死亡病例和輕癥病例感染的C4a基因型EV-A71基因組序列。本研究共從GenBank上下載29條導致死亡病例和30條引起手足口病輕癥病例的EV-A71全基因組序列(GenBank序列號分別為:MG208882,HQ129932,FJ194964,EU703812,EU703813,EU703814,FJ607337,JF913464,FJ606447,FJ606448,FJ606450,FJ828519,EU864507,JX678875,JX678876,FJ439769,FJ607334,GQ231933,FJ607335,FJ607336,GU366191,JN256059,JN256062,JX244186,GQ994989,GQ994990,GQ994991,JX244182,GQ994992,JX244183,JX244184,JX678880,JX678881,HQ891926,HQ891927,HQ891929,JN864018,JN864019,JN864020,HQ828086,KJ004560,HQ712020,JF830007,KJ004552,KJ004553,KC570453,KF444809,KP198623,KP198624,KJ004554,KJ004555,MF405075,MF431793,KT428644,KT428645,KT428646,KT428647,KT428648,KT428649,KT428650)。增加本研究的1例死亡病例和1例輕癥病例基因組序列,一共用于分析的基因組序列為:30條序列來源于EV-A71死亡病例,31條序列來源于輕癥病例。

1.2 EV-A71基因組序列擴增、測序 對本研究的2株EV-A71毒株進行基因組擴增:采用 QIAamp viral RNA Minikit(QIAGEN,德國)提取病毒核酸。采用隨機引物和Super-ScriptⅡ逆轉錄酶在42℃對病毒RNA進行逆轉錄1.5 h。使用9對特異引物對cDNA進行PCR擴增(見表1)。體系配置及反應條件按照試劑盒說明書進行。末端序列測定采用商品化RACE試劑盒(TaKaRa Biomedicals)進行。采用ABI公司的BigDye terminator v3.1 cycle sequencing kit試劑和BigDye X-terminator試劑,應用 ABI3100全自動遺傳分析儀進行序列分析,產物使用雙向測序。

1.3 基因組序列整理 對于獲得的EV-A71基因序列使用 Sequencher4.10.1軟件(GeneCode,AnnArbor,Michigan,USA)對每個樣本的雙向序列進行手動拼接,參照序列峰圖進行人工校讀,校讀完畢后將序列以文本文檔的形式保存。

表1 EV-A71基因組序列擴增測序引物Tab.1 Genome amplification sequencing primers of EV-A71

1.4 EV-A71的5′UTR二級結構預測分析 根據脊髓灰質炎病毒的內部核糖體進入位點第5結構域與其毒力密切相關［3］,EV-A71的5′UTR 的第 453-561堿基與該結構域對應。本研究使用RNAfold軟件對本研究的3個EV-A71基因組5′UTR的第5個結構域進行二級結構預測。

1.5 氨基酸殘基性質分析 依據氨基酸殘基的親水性、殘基大小和化學性質對氨基酸進行分類。依據Kyte and Doolittle［4］的氨基酸親水性參數將氨基酸分為三類:疏水性氨基酸,中性氨基酸和親水性氨基酸；依據氨基酸殘基的大小分五類:很小、小、中、大、很大；根據氨基酸殘基的化學特性,將其分為11類:脂肪族氨基酸、含硫氨基酸、含羥基氨基酸、酸性氨基酸、酰胺氨基酸、堿性氨基酸和其他5種單獨分類的氨基酸。

1.6 基于蛋白晶體結構分析EV-A71的潛在毒力位點 利用Swiss-model同源建模的方法從GenBank上下載已發(fā)表的EV-A71蛋白的晶體結構,利用Pymol軟件展示各蛋白三維空間結構,標記具有潛在毒力的氨基酸位點。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用卡方檢驗分析EV-A71某位點上的不同氨基酸在輕癥和死亡病例分布的差異是否有統(tǒng)計學意義,計算OR值分析氨基酸位點與病毒毒力的相關性。以p＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義,數據利用 SPSS(version 19.0,IBM SPSS Statistics)分析。

2 結果

2.1 EV-A71基因組序列同源性分析 通過對1株來源于輕癥病例的毒株和1株來源于死亡病例的毒株的VP1(891 bp)序列與EV-A71參考株進行序列比對,本研究的2株EV-A71均屬C4a基因型。2個基因組序列的同源性是97.5%,5′UTR區(qū)核苷酸同源性為97.9%。P1區(qū)核苷酸同源性為98.0%,P2區(qū)為96.7%,P3區(qū)為97.3%。

2.2 EV-A71的5′UTR區(qū)結構預測 對來源于輕癥和死亡病例的EV-A71毒株5′UTR的第453-561堿基序列進行二級結構預測［5］,結果顯示二者的二級結構完全相同(圖1)。

2.3 氨基酸位點分析 將本研究中的EV-A71的編碼蛋白區(qū)基因經比對后翻譯成氨基酸,61條序列氨基酸數目相同,同源性為95.9%。以EV-A71參考株U22521為參照,分析以上序列的氨基酸位點變異。

在EV-A71的結構蛋白區(qū)和非結構蛋白區(qū)每個氨基酸位點有2條及以上序列不同的納入χ2檢驗,同時認為易出現在死亡病例來源的氨基酸為潛在的毒力位點,共獲得4個氨基酸位點,各位點在死亡病例和輕癥病例的構成比差異具有統(tǒng)計學意義(見表2)。2 A區(qū)第68位有精氨酸(R)和蛋氨酸(M)兩種氨基酸,分析結果顯示死亡病例的該位點更易出現M。2C區(qū)的第41位有R和賴氨酸(K),在死亡病例的該位點更易出現R。3 A區(qū)的第47位有蘇氨酸(T)、纈氨酸(V)和丙氨酸(A),其中1例死亡病例該位點為V,其余24位死亡病例該位點為A,相對于該位點為T的輕癥病例。3C區(qū)的第158位有V和I兩種氨基酸,死亡病例的該位點更易出現V。用2 A區(qū)R68 M、2C區(qū)K41R、3 A區(qū)T47 A及3C區(qū)I158 V作為衡量標準,結果顯示以上每個氨基酸位點的敏感度分別為86.7%(26/30)、83.3%(25/30)、83.3%(25/30)和 89.3%(27/30)。

圖1 RNAfold軟件預測EV-A71的5′UTR的第453-561堿基空間結構A:death case,B:mild caseFig.1 Predicted 5′UTR secondary structure of EV-A71 from base 543 to 561 by RNA fold

在GenBank下載與EV-A71的2 A、3A和3C等高度同源的蛋白結構數據(PDB編號分別為:3W95、1ng7、3sjo),其中 3W95 與 2 A 蛋白、1ng7 與3 A蛋白、3sjo與3C蛋白的同源性分別為97.3%、46.55%和98.9%。以本研究死亡病例毒株的2 A、3A及3C等氨基酸序列作為目標序列,利用SWISSModel的同源建模法構建蛋白空間結構,由于未能成功獲得與2C蛋白高度同源的蛋白空間結構模板,因此利用I-TASSER軟件對2C蛋白進行結構預測。用PyMOL軟件進行結果的渲染。結果顯示(圖2):2 A和3A蛋白均是二聚體結構,2 A的68位、2C的41位及3 A的47位氨基酸殘基位于各自蛋白的表面,3C區(qū)158位氨基酸殘基位于3C蛋白結構的凹陷處。

表2 EV-A71毒株氨基酸編碼區(qū)的潛在毒力位點分析Tab.2 Analysis of the potential virulence sites of EV-A71 virion amino acid coding regions

圖2 Pymol軟件呈現的2 A、2C、3 A和3C蛋白Note:Red represents α-helix,green represents β-fold and blue represents random curl.The purple ball represents the 68thresidue on 2 A protein,the 41stresidue on 2C,the 47thresidue on 3 A protein and the 158thresidue on 3C proteinFig.2 Predicted protein structure of 2 A,2C,3 A and 3C with PyMOL software

3 討論

EV-A71是手足口病的主要病原之一,與其他病原相比,EV-A71相關手足口病具有更高的重癥率和死亡率［6］。EV-A71和脊髓灰質炎病毒同屬腸道病毒屬,文獻報道脊髓灰質炎病毒的毒力基因位于5′UTR的第5個結構域,通過對EV-A71進行比對發(fā)現來源于輕癥和死亡病例的EV-A71該區(qū)結構完全相同,不能依據該區(qū)的結構判斷EV-A71的毒力。

國內外多個研究對EV-A71毒株的潛在毒力位點開展研究,文獻報道:EV-A71的VP1145E變異株可引起病毒血癥,產生神經病變［7］；VP2(149 M)突變可以提高病毒結合能力,導致小鼠死亡［8］。本研究通過EV-A71氨基酸序列比對,未發(fā)現輕癥和死亡病例來源的EV-A71在VP1的145位和VP2的149位氨基酸差異有統(tǒng)計學意義。本研究在EVA71的非結構蛋白區(qū)共獲得4個輕癥病例和死亡病例差異具有統(tǒng)計學意義的氨基酸位點。EV-A71的2 A蛋白酶誘導真核細胞起始因子4G(eIF-4G)的裂解,阻止宿主蛋白的合成［9］。研究發(fā)現 EV-A71的2 A蛋白酶的63～65,及73位高度保守,與底物結合相關［9］,本研究發(fā)現2 A區(qū)68位氨基酸位于蛋白空間結構的表面,死亡病例的EV-A71在2 A區(qū)68位更易出現M,M是非極性中性氨基酸,輕癥病例該位點較易出現R,R是極性帶正電荷的堿性氨基酸,推測蛋白質表面氨基酸性質的改變可能導致酶功能的改變。

2C蛋白是一個高度保守的蛋白質,具有ATP酶活性通過招募宿主細胞編碼的網狀蛋白質3形成復制復合物來參與病毒的復制［10］。本研究結果顯示死亡病例EV-A71的2C區(qū)41位氨基酸更易出現R,部分輕癥病例該位點為K,R和K都是親水性帶正電荷的堿性氨基酸,由于二者均為親水性氨基酸,推測R和K側鏈基團的不同可能影響酶功能。

EV-A71的3 A蛋白有87個氨基酸殘基,3 A蛋白可以調節(jié)宿主細胞的胞膜內運輸。在RNA復制過程中,3 A蛋白通過其疏水區(qū)促進囊膜與復制復合體結合以及病毒RNA的合成［11］。本研究發(fā)現3 A區(qū)47位氨基酸位于具有水溶性的N端,由T變?yōu)锳,氨基酸發(fā)生由中性向疏水性的改變可能會導致二聚體蛋白質結構功能的改變。

EV-A71的3C蛋白酶可以促進病毒復制,抑制宿主細胞轉錄,與中樞神經系統(tǒng)發(fā)病有密切的關系［12］。研究結果顯示 Rupintrivir與 EV-A71的3C蛋白酶的第142～147,161～165等等高度保守的氨基酸殘基形成的口袋以較高親和力結合,可導致3C蛋白酶不可逆失活［13］,本研究結果顯示死亡病例在3C區(qū)158位易出現V,位于口袋內側,與高度保守位點161位置臨近,同位于一個β折疊上。部分輕癥病例該位點為I,V和I均是疏水性氨基酸,I較V有更大的疏水側鏈,其剛性結構特征及疏水相互作用都對蛋白質折疊有重要的影響力,氨基酸的變化可能導致酶空間結構發(fā)生改變對蛋白功能產生影響。

本研究的局限性有兩方面:一是本研究中的死亡病例EV-A71序列均在Genbank上獲得,在收集盡量多死亡病例序列后依據其地理、年代等信息收集對應的輕癥病例序列,但由于死亡病例基因組數量非常有限,研究所選的基因組序列在年代和地理的代表性上有局限性。二是發(fā)現的可能的毒力位點仍需更多基因組序列進行毒力位點的驗證,需要進行反向遺傳學實驗和恰當動物模型加以進一步證實。

綜上所述,本研究基于EV-A71基因組對引起手足口病的EV-A71進行分析,發(fā)現輕癥和死亡病例EV-A71的5′UTR核苷酸的第ⅴ區(qū)與毒株的毒力不相關,非結構蛋白區(qū)部分氨基酸位點的變異可能與C4a基因型的EV-A71的毒力相關。

利益沖突:無