寧 波，李朵璐，闞全程

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科 450000)

膀胱瘤是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，它具有發(fā)病率高、復(fù)發(fā)率高、惡性程度低等特點(diǎn)[1]。膀胱癌患者的主要癥狀為血尿，臨床上常采用造影和膀胱鏡檢作為膀胱腫瘤的診斷方法。膀胱癌可分為表淺性和浸潤(rùn)性?xún)深?lèi)，表淺性膀胱癌具有復(fù)發(fā)率高，轉(zhuǎn)移率低的特點(diǎn)。浸潤(rùn)性膀胱癌具有浸潤(rùn)性和轉(zhuǎn)移率高等特點(diǎn)[2]。樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)是一種抗原遞呈細(xì)胞，具有攝取、加工及遞呈抗原，刺激T細(xì)胞活化和增殖，啟動(dòng)機(jī)體特異性免疫應(yīng)答等功能，因此在腫瘤免疫過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，如果DC數(shù)量減少或者功能缺失，使得DC不能刺激淋巴細(xì)胞增殖及免疫應(yīng)答，最終導(dǎo)致機(jī)體免疫耐受，從而使腫瘤細(xì)胞逃脫機(jī)體免疫系統(tǒng)，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程中起重要作用[4]。研究證實(shí)DC與膀胱癌有十分緊密的關(guān)系，與膀胱癌的分級(jí)和患者預(yù)后有緊密聯(lián)系[4-5]。

DC在發(fā)育過(guò)程中能表達(dá)一系列分化抗原，其中最直接與其功能有關(guān)的是CD1a，CD1a主要表達(dá)于人胸腺細(xì)胞，是鑒定人外周血與骨髓中DC的最好標(biāo)記[6]。CD83是DC成熟的標(biāo)志，在DC發(fā)育成熟的早期不表達(dá)CD83，當(dāng)成熟時(shí)才表達(dá)CD83。由于腫瘤細(xì)胞CD83的低水平表達(dá)，不能使腫瘤抗原引起有效的免疫應(yīng)答，從而誘導(dǎo)了T細(xì)胞的無(wú)能狀態(tài)，使得機(jī)體的免疫系統(tǒng)不能將腫瘤細(xì)胞清除，是腫瘤無(wú)限制性生長(zhǎng)的主要原因之一[7]。膀胱癌細(xì)胞BIU-87來(lái)源于人膀胱乳頭狀移行上皮癌，通常采用5×108細(xì)胞0.2 mL接種裸鼠皮下，腫瘤呈進(jìn)行性生長(zhǎng)，腫瘤結(jié)節(jié)病理檢查與原標(biāo)本癌組織相似，是臨床實(shí)驗(yàn)室常用的實(shí)驗(yàn)用途膀胱癌細(xì)胞系。

斑蝥酸鈉是斑蝥素的一種衍生物，目前臨床上用于治療肝癌和胃癌，與先導(dǎo)化合物斑蝥素比較，斑蝥酸鈉具有毒性低和刺激性小等特點(diǎn)[8-11]。斑蝥酸鈉抗腫瘤機(jī)制復(fù)雜多樣，它能通過(guò)多種途徑抑制腫瘤細(xì)胞，其中包括阻斷細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移、提高患者機(jī)體免疫力等[12-14]。

在本實(shí)驗(yàn)中，一方面研究斑蝥酸鈉對(duì)膀胱癌患者外周血來(lái)源的DC的成熟及功能的影響，另一方面研究斑蝥酸鈉對(duì)膀胱癌細(xì)胞BIU-87增殖和凋亡的影響，進(jìn)而從改變患者機(jī)體免疫力和抑制膀胱腫瘤細(xì)胞來(lái)綜合探討斑蝥酸鈉的作用，為斑蝥酸鈉臨床應(yīng)用于膀胱癌患者提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rh-GM-CSF)和重組人白細(xì)胞介素-4(rh-IL-4)(R&D Systems，USA)；FITC標(biāo)記的抗人CD1a和CD83(USA)；Caspase-3、PARP、GAPDH一抗、HRP標(biāo)記二抗(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)；Ficoll paque plus淋巴細(xì)胞分離液(GE Amersham Biosciences，USA)；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(HyClone Laboratories，USA)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒和AimexinV-FITC凋亡檢測(cè)試盒(碧云天生物技術(shù)研究所)。

1.2DC體外培養(yǎng)及給藥方法 選取15例膀胱癌患者及10例健康成人，每人抽取靜脈血20 mL，采用Ficoll Paque Plus淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單核細(xì)胞，在37 ℃，5% CO2的條件下培養(yǎng)2 h后，洗滌除去懸浮細(xì)胞，得到貼壁細(xì)胞。然后用含GM-CSF(1 000 IU/mL)、IL-4(500 IU / mL)和10%自體血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，每24 h半量換液。在第5天將培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行分組試驗(yàn)，分成以下組別：對(duì)照組(Control)、斑蝥酸鈉低劑量組(0.01 μg/mL)、斑蝥酸鈉中劑量組(0.05 μg/mL)、斑蝥酸鈉高劑量組(0.25 μg/mL)、健康人組，第8天收集細(xì)胞行相關(guān)檢測(cè)。

1.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC表面CD1a和CD83的變化 分別收集第8天的細(xì)胞，然后加入CD1a和CD83熒光抗體，室溫、暗室避光孵育30 min，然后再加入2 mL預(yù)冷磷酸緩沖液，最后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組DC表面CD1a和CD83的表達(dá)情況。

1.4MTT法檢測(cè)斑蝥酸鈉對(duì)DC刺激淋巴細(xì)胞增殖的影響 取健康體檢人靜脈血，分離出單核細(xì)胞，在37℃，5% CO2的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，2 h后吸取未貼壁的細(xì)胞，得到的即為淋巴細(xì)胞。收集培養(yǎng)第8天的各組DC并用絲裂霉素C(50 g/mL)孵育30 min，調(diào)整細(xì)胞密度為1×107/L，按照DC與淋巴細(xì)胞比例為1∶10混合，將混合細(xì)胞集中于96孔板，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，連續(xù)培養(yǎng)48 h后，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，在570 nm處檢測(cè)各孔吸光度值，按照公式計(jì)算淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)。刺激指數(shù)=試驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值。

1.5MTT法檢測(cè)斑蝥酸鈉對(duì)膀胱癌BIU-87細(xì)胞的抑制作用 BIU-87細(xì)胞用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組(不加藥物)、10 μg/mL斑蝥酸鈉組、20 μg/mL斑蝥酸鈉組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)12、24、36和48 h后，加入MTT工作液，繼續(xù)孵育4 h后，加入100 μL DMSO，酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm的吸光度值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.6Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)斑蝥酸鈉對(duì)膀胱癌BIU-87細(xì)胞凋亡的影響 按照1.5的分組方法，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BIU-87細(xì)胞分別接種于6孔板中，給藥作用24 h后，消化、離心收集細(xì)胞，然后加入0.3 mL的結(jié)合緩沖液，混勻，每個(gè)測(cè)試樣品加入5 μL Annexin V和5 μL PI，在室溫孵育15 min后，補(bǔ)加0.2 mL結(jié)合緩沖液，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.7Western blot法檢測(cè)Caspase-3和PARP的表達(dá)的變化 按照1.5方法處理細(xì)胞后，細(xì)胞用胰酶消化，收集細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液破碎細(xì)胞，低溫離心5 min，收集上清液即為提取蛋白。用BCA法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定，采用SDS-PAGE法進(jìn)行電泳，濕法轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉，分別加入Caspase-3、PARP和GAPDH一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，滴加HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h后，暗室滴加ECL發(fā)光液，掃描紀(jì)錄。

A：對(duì)照組；B：低劑量組；C：中劑量組；D：高劑量組；E：健康人組

圖1 DC形態(tài)(×400)

2 結(jié) 果

2.1流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC、CD1a和CD83的變化 倒置顯微鏡拍照結(jié)果見(jiàn)圖1，與對(duì)照組相比，斑蝥酸鈉處理組細(xì)胞體積變大，細(xì)胞變長(zhǎng)，斑蝥酸鈉高劑量組(圖1D)細(xì)胞出現(xiàn)突起，形如樹(shù)枝，和健康人組(圖1E)的細(xì)胞形態(tài)類(lèi)似。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，與對(duì)照組相比，CD83與CD1a在斑蝥酸鈉處理組中顯著升高(P<0.05)。另外CD83與CD1a在斑蝥酸鈉高劑量組中表達(dá)最高，且與健康人組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

*：P<0.05，**：P<0.01，與對(duì)照組比較；#：P<0.05，##：P<0.01，與健康人組比較

圖2 CD1a和CD83在DC中的表達(dá)

2.2斑蝥酸鈉刺激異體淋巴細(xì)胞增殖能力的檢測(cè) 與對(duì)照組相比，斑蝥酸鈉處理組刺激淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。另外在斑蝥酸鈉各劑量組中，高劑量組刺激淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)最高，且與健康人組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖3。

*：P<0.05，**：P<0.01，與對(duì)照組比較；#：P<0.05，##：P<0.01，與健康人組比較

圖3斑蝥酸鈉刺激異體淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)

2.3MTT法檢測(cè)斑蝥酸鈉對(duì)膀胱癌BIU-87細(xì)胞的抑制作用 與對(duì)照組相比，各給藥組中細(xì)胞存活率均有不同程度的降低，藥物的抑制作用隨斑蝥酸鈉濃度和時(shí)間的增加而增大，同一時(shí)間點(diǎn)不同處理組之間相比，細(xì)胞存活率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖4。

**：P<0.01，與對(duì)照組比較

圖4 MTT法檢測(cè)不同濃度斑蝥酸鈉處理后細(xì)胞的存活率

2.4Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)斑蝥酸鈉對(duì)膀胱癌BIU-87細(xì)胞凋亡的影響 斑蝥酸鈉組與對(duì)照組相比，細(xì)胞凋亡率顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖5。

**：P<0.01，與對(duì)照組比較

圖5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同處理組細(xì)胞凋亡狀況

2.5Western blot法檢測(cè)caspase-3和PARP蛋白表達(dá)的變化 與對(duì)照組相比，斑蝥酸鈉組BIU-87細(xì)胞中Caspase-3和PARP蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)(P<0.01)，見(jiàn)圖6。

**：P<0.01，與對(duì)照組比較

圖6 Western blot法檢測(cè)Caspase-3和PARP蛋白的表達(dá)

3 討 論

膀胱癌是最常見(jiàn)惡性腫瘤之一，臨床上主要采用保留膀胱的手術(shù)治療。這種治療方法會(huì)使腫瘤切除不徹底，導(dǎo)致一半左右的患者2年內(nèi)腫瘤的復(fù)發(fā)率非常高。目前，為了解決這一弊端，臨床上在患者進(jìn)行手術(shù)后，進(jìn)行膀胱內(nèi)灌注藥物治療，但是膀胱癌腫瘤常常發(fā)生耐藥現(xiàn)象。斑蝥酸鈉作為從天然化合物優(yōu)化而來(lái)的化合物，不僅具有抗腫瘤活性，而且還能夠調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能。斑蝥酸鈉具有相對(duì)分子質(zhì)量小，容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的特點(diǎn)，另外還能提高患者免疫力。目前，臨床上采用斑蝥酸鈉與其他抗腫瘤藥物聯(lián)合，主要應(yīng)用于肺癌、胃癌和老年膀胱癌等腫瘤的治療[15-17]。斑蝥酸鈉能夠提高機(jī)體免疫功能，通過(guò)增加白細(xì)胞的數(shù)量，使得細(xì)胞因子分泌增多，提高免疫反應(yīng)的速度和強(qiáng)度[18-19]。

DC能夠攝取抗原，然后將抗原進(jìn)行處理成具有免疫原性的多肽，在細(xì)胞表面表達(dá)MHC-抗原肽復(fù)合物，另外DC膜表面的特異分子能與淋巴細(xì)胞表面相應(yīng)的配體結(jié)合，使抗原特異性T細(xì)胞得到激活和增殖，最終激活機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答[20-22]。DC廣泛分布于體內(nèi)各個(gè)部分，但是整體細(xì)胞數(shù)量少，不能滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用的要求，所以已經(jīng)開(kāi)發(fā)出多種途徑產(chǎn)生大量DC，來(lái)源主要包括骨髓、臍血、外周血，其中最常用的途徑為采集機(jī)體外周血，誘導(dǎo)成為DC[23]。

本實(shí)驗(yàn)從患者外周靜脈血中梯度離心得到分離PBMC細(xì)胞，然后進(jìn)行純化，剩余的貼壁細(xì)胞即為單核細(xì)胞，利用GM-CSF和IL-4誘導(dǎo)單核細(xì)胞轉(zhuǎn)化成DC。采用顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化，然后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)了DC表面的CD1a和CD80的表達(dá)情況。CD1a作為DC的特異性標(biāo)志，CD1a表達(dá)量能夠顯示DC的數(shù)量，另外CD83分子是DC的成熟的標(biāo)志[24-25]。

研究結(jié)果證明，斑蝥酸鈉與DC共孵育后，培養(yǎng)細(xì)胞表面產(chǎn)生突起，形如樹(shù)枝，同時(shí)DC表面CD1a和CD80的表達(dá)顯著升高，斑蝥酸鈉高劑量組與健康人組DC比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。另外采用MTT方法檢測(cè)了斑蝥酸鈉對(duì)DC刺激淋巴細(xì)胞增殖能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)斑蝥酸鈉能夠增強(qiáng)淋巴細(xì)胞增殖能力。表明斑蝥酸鈉能夠增強(qiáng)膀胱癌患者DC的形成和CD1a與CD80分子的表達(dá)，進(jìn)而提高患者的免疫能力。

細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的變化導(dǎo)致細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)的產(chǎn)生，進(jìn)而會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生自毀性死亡，即細(xì)胞凋亡。多種基因參與細(xì)胞的凋亡的整個(gè)過(guò)程，其中Caspase-3在此過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，當(dāng)Caspase-3被激活后，細(xì)胞將會(huì)進(jìn)入不可逆的凋亡進(jìn)程，而且多種因素誘導(dǎo)的凋亡很大一部分都通過(guò)Caspase-3這一信號(hào)途徑實(shí)現(xiàn)。PARP是一種DNA修復(fù)酶，定位于細(xì)胞核內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞通過(guò)Caspase-3導(dǎo)致凋亡產(chǎn)生時(shí)，活化的PARP Caspase-3能夠剪切激活PARP，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)MTT法證明斑蝥酸鈉能夠顯著抑制膀胱癌BIU-87細(xì)胞的生長(zhǎng)，且呈劑量和時(shí)間依賴(lài)性。通過(guò)Annexin V-FITC/PI雙染法證明斑蝥酸鈉能夠誘導(dǎo)膀胱癌BIU-87細(xì)胞發(fā)生凋亡。另外進(jìn)一步研究了斑蝥酸鈉對(duì)凋亡蛋白Caspase-3和PARP表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，斑蝥酸鈉組BIU-87細(xì)胞中Caspase-3和PARP蛋白表達(dá)升高，促進(jìn)BIU-87細(xì)胞發(fā)生凋亡。

綜上所述，斑蝥酸鈉一方面能夠促進(jìn)膀胱癌患者DC的成熟和增加DC刺激淋巴細(xì)胞的增殖能力，另一方面能夠抑制膀胱癌BIU-87細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)其發(fā)生凋亡。本研究為斑蝥酸鈉治療膀胱癌的臨床應(yīng)用提供了一種新的策略，即膀胱灌注高劑量斑蝥酸鈉殺滅腫瘤細(xì)胞，然后體內(nèi)給予低劑量斑蝥酸鈉激活機(jī)體免疫系統(tǒng)。