方瑞娜，張婷婷，景靜，高峰青

（1.黃河水利職業(yè)技術學院環(huán)境與化學工程系，河南開封475004；2.開封市綠色涂層材料重點實驗室，河南開封475004；3.國家安全生產(chǎn)監(jiān)督管理總局培訓中心，北京100012）

十香菜，草本植物，即“留蘭香”。在民間具有廣泛的食用和藥用價值[1－2]。因其精油具有特殊的香味而用作牙膏、香皂、糖果、煙酒等調(diào)味香料[3－4]。目前，常見提取方法主要有溶劑提取法、超臨界CO2萃取法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法[5－8]。其中溶劑提取法耗時較長，操作繁瑣；超臨界CO2萃取法提取效率高，無污染，但其成本高，費用貴；超聲波提取法提取時間短，簡單易行，但易形成超聲空白區(qū)而影響提取效率；而微波輔助提取法耗時短，提取效率高，成本適中，因此成為目前研究的熱點[9－12]。黃酮的測定方法常見的有兩種[13－15]，其一因不能排除非黃酮類物質(zhì)的干擾而較少運用；另一個穩(wěn)定性高且抗干擾能力強，是目前應用較為廣泛的檢測方法[16－19]。因此，本研究選用微波輔助法進行提取，采用亞硝酸鈉－硝酸鋁－氫氧化鈉分光光度法檢測黃酮含量，設計正交試驗對相應試驗條件進行探討，為十香菜的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

十香菜：河南；無水乙醇（分析純）：濟南嘉?；び邢薰?；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉（分析純）：蘇州嘉鼎化學科技有限公司；過氧化氫、水楊酸、硫酸亞鐵（分析純）：河南雪弈生物科技有限公司；DPPH（分析純）：上海思域化工科技有限公司。

1.2 儀器與設備

ISO9001超聲微波組合反應系統(tǒng)：南京先歐儀器制造有限公司；EU－2200R紫外可見分光光度計：上海添時科技儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預處理

清洗十香菜，烘干，粉碎并過篩，裝瓶。

1.3.2 蘆丁標準曲線的繪制

參考馬金菊等[20]方法進行標準曲線的繪制：移取不同體積蘆丁標準液于比色管中，依次加入試劑，30%乙醇定容，搖勻靜置。測定吸光度。繪制標準曲線。

1.3.3 黃酮類物質(zhì)的提取

準確稱取樣品1.000 0 g，與不同體積分數(shù)的乙醇混合、攪拌并靜置15 min，選擇不同的液料比、微波功率、微波時間制得待測樣品提取液過濾后，30%乙醇定容。

1.3.4 黃酮類物質(zhì)提取率的計算

移取提取液至比色管中，測定吸光度。提取率計算公式如下：

式中：ρ為黃酮類物質(zhì)提取率，mg/g；C為黃酮質(zhì)量體積分數(shù)，mg/mL；V為黃酮提取液體積，mL；M為樣品質(zhì)量，g。

1.3.5 黃酮提取條件優(yōu)化單因素試驗

設4個單因素（乙醇用量、微波時間、微波功率、液料比），考察對十香菜中黃酮提取率的影響。

1.3.6 優(yōu)化正交試驗條件

根據(jù)單因素試驗結(jié)果確定最優(yōu)條件，設計四因素四水平正交試驗，探索最佳試驗參數(shù)。

1.3.7 十香菜黃酮抗氧化性實驗

以DPPH自由基和·OH清除率來考察十香菜中黃酮的抗氧化性。

1.3.7.1 DPPH自由基的清除

參考金杜欣等[21]方法，配制DPPH溶液，無水乙醇做參比，測定吸光度。公式如下：

式中：Ai為DPPH溶液吸光度值；Ax為樣品液和DPPH溶液吸光度值；Ae為不含DPPH溶液時樣品液吸光度值。

1.3.7.2 ·OH的清除

參照賈之慎等[22－25]的方法，取不同體積分數(shù)的樣品液，依次加入試劑，蒸餾水作參比，測定吸光度。公式如下：

式中：A0為生成的·OH溶液吸光度值；A1為樣品液和生成·OH溶液吸光度值；A2為樣品液吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線

蘆丁標準曲線如圖1所示。

圖1 蘆丁標準曲線Fig.1 The standard curve of rutin

試驗獲得蘆丁標準系列方程為：y=9.2661x+0.0092，R2=0.999 3，該標準曲線在0～0.01 mg/mL范圍內(nèi)呈線性關系。

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 乙醇用量對十香菜黃酮提取率的影響

乙醇用量對十香菜黃酮提取率的影響如圖2所示。

圖2 乙醇用量對十香菜黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of Percentage of ethanol content on the extraction rate of flavonoids from ten coriander

由圖2可以看出，乙醇用量在80%之前提取率表現(xiàn)為正相關，乙醇用量在80%時提取率最大，之后表現(xiàn)為負相關。推測乙醇用量太大，可能會溶出醇溶性雜質(zhì)脂類物質(zhì)。因此，乙醇用量選擇80%。

2.2.2 液料比對十香菜黃酮提取率的影響

液料比對十香菜黃酮提取率的影響如圖3所示。

圖3 液料比對十香菜黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of liquid-solid ratio on the extraction rate of flavonoids from ten coriander

由圖3可以看出，在液料比為50∶1（mL/g）之前提取率表現(xiàn)為正相關，之后表現(xiàn)為負相關，液料比為50∶1（mL/g）時提取率最大。因此，液料比選擇50 ∶1（mL/g）。

2.2.3 微波時間對十香菜黃酮提取率的影響

微波時間對十香菜黃酮提取率的影響如圖4所示。

由圖4得出，提取率隨著提取時間的增加表現(xiàn)為正相關，4 min時提取率最大，4 min后表現(xiàn)為負相關。推測超聲時間過長導致乙醇揮發(fā)較快。因此，微波時間確定為4 min。

圖4 微波時間對十香菜黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of microwave time on the extraction rate of flavonoids from ten coriander

2.2.4 微波功率對十香菜黃酮提取率的影響

微波功率對十香菜黃酮提取率的影響如圖5所示。

圖5 微波功率對十香菜黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of microwave power on the extraction rate of flavonoids from ten coriander

由圖5看出，提取時間增加提取率表現(xiàn)為正相關，在微波功率400 W時最高，微波功率繼續(xù)增大提取率表現(xiàn)為負相關，推測提取功率的增大促使乙醇揮發(fā)速率加快。因此，選擇微波功率為400 W。

2.3 正交試驗結(jié)果

為選本試驗的最佳條件，根據(jù)單因素試驗結(jié)果，設計四因素四水平正交試驗，探索最佳試驗參數(shù)，具體如表1所示。按照正交試驗表2進行試驗。試驗結(jié)果見表2。

表1 黃酮提取條件優(yōu)化正交試驗表Table 1 Flavonoids extraction conditions optimization orthogonal test table

表2 黃酮提取條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 2 Factors and levels of orthogonal experiments for flavonoids extraction conditions optimization

試驗結(jié)果表明，影響各因素的重要性為：A>D>C>B。最佳方案是A2D2C4B2，即乙醇用量為70%，微波時間3 min，液料比60∶1（mL/g），微波功率400 W。為進一步驗證該試驗的準確性，依照上述試驗條件重復提取5次進行測定，結(jié)果如下：提取率分別為8.34%、8.38%、8.37%、8.35%、8.39%，得提取率平均值為8.37%，高于正交試驗其他組合，因此該條件為正交優(yōu)化試驗最佳條件，說明此方案可實施性較強。

2.4 抗氧化能力測定結(jié)果分析

十香菜中黃酮類物質(zhì)以及VC對DPPH自由基、·OH影響見圖6和圖7。

由圖6和圖7可以看出，十香菜中黃酮類物質(zhì)對DPPH自由基清除率最大達到89.70%，對·OH清除率最大達到82.49%，而VC清除率最大達到92.13%，證明二者均具有較好的抗氧化性，但其最高清除率均低于VC。

圖6 十香菜中黃酮VC對DPPH自由基的清除率Fig.6 Scavenging rate of ten coriander and VCon DPPH free radica

圖7 十香菜中黃酮VC對·OH清除率Fig.7 Scavenging rate of ten coriander and VCon hydroxyl free radical

3 結(jié)論

1）本試驗以十香菜為研究對象，設計正交試驗，對黃酮類成分進行探討，確定最佳提取條件。試驗結(jié)果表明，影響提取因素的主次關系為，乙醇用量A>微波功率D>液料比C>微波時間B。最佳試驗條件為：乙醇用量為 70%、微波時間 3min、液料比 60 ∶1（mL/g）、微波功率400 W，該條件下其提取率為8.37 mg/g。結(jié)果表明十香菜中黃酮類成分含量較高。

2）體外抗氧化性試驗結(jié)果表明，十香菜提取液對DPPH自由基清除率達89.70%，對·OH清除率達到82.49%，表明十香菜中黃酮作為天然綠色抗氧化劑，具有較強的體外抗氧化能力，可以有效抑制癌細胞的增長、提高機體免疫能力，對細胞過氧化衰老具有一定抑制作用。