張 樂，寧 越，李佩韋，王洪寶，2，昝林森，2*

(1. 西北農(nóng)林科技大學動物科技學院，楊凌 712100； 2. 國家肉牛改良中心，楊凌 712100)

牛肉不僅肉質(zhì)鮮美，而且具有高蛋白、低脂肪和低膽固醇等特點，其營養(yǎng)價值遠高于其他肉類[1]。隨著經(jīng)濟的發(fā)展和人們生活水平提高，牛肉供不應求，提高牛肉的產(chǎn)量和品質(zhì)是迫在眉睫的問題[2]。一系列的研究表明，畜禽的產(chǎn)肉性能和肉品質(zhì)離不開對骨骼肌生長發(fā)育及肌內(nèi)脂肪含量的研究。TGF-β(transforming growth factor-β,TGF-β)信號通路調(diào)控了間充質(zhì)干細胞的分化，抑制了脂肪細胞和成肌細胞的分化[3-5]。而Smad蛋白家族是將TGF-β與其受體結(jié)合后產(chǎn)生的信號從細胞膜傳導到細胞核的重要中介分子。目前，Smad共分為3個不同的亞族：受體激活型Smads(receptor-activated Smad，R-Smad)主要包括Smad1、Smad2、Smad3、Smad5、Smad8和Smad9，可將TGF-β信號直接從細胞膜轉(zhuǎn)導入細胞核內(nèi)；共同通路型Smad(common Smad, C-Smad)即Smad4；抑制型Smads(inhibitory Smads, I-Smad)主要包括Smad6、Smad7[6-7]。Smad2/Smad3屬于R-Smad，是TGF-β信號通路的直接作用底物，更是信號下傳的第一個信號分子。而目前已有研究證明，在TGF-β1抑制成肌分化過程中起關(guān)鍵作用的是Smad3而非Smad2，同時Smad3表達水平的上調(diào)可抑制成肌調(diào)節(jié)因子的表達[8-9]。

目前對Smad3基因的研究主要是集中在哺乳動物胚胎發(fā)育時期以及出生后肌肉生長發(fā)育過程的調(diào)節(jié)，但其在成脂調(diào)控中的作用鮮有報道。有研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1抑制脂肪細胞分化的調(diào)控機制主要是通過與Smad3和Wnt /β-catenin信號通路之間的交流，從而下調(diào)了PPARγ(peroxisome proliferator-activated receptor γ)的表達[10]?！半p肌臀基因”肌肉抑制素(Myostatin)是TGF-β1家族成員之一，在機體內(nèi)主要擔任負調(diào)節(jié)作用。研究證明，MSTN抑制骨骼肌細胞生長、抑制褐色脂肪細胞分化和降低白色脂肪褐色化主要是通過調(diào)控Smad3基因控制的β-catenin的積累[11-12]。視黃素抑制脂肪細胞分化時，也需要與Smad3基因結(jié)合共同起作用[13]。這些研究表明，Smad3基因在脂肪和肌肉的生長發(fā)育過程中都起著負調(diào)控作用。

鑒于Smad3基因的重要功能，以及應用腺病毒介導技術(shù)以實現(xiàn)對秦川牛前體脂肪細胞的高效侵染和持續(xù)表達來研究該基因的功能尚未見報道。因此，本試驗以秦川牛脂肪組織為試驗材料，克隆秦川牛Smad3基因，構(gòu)建了腺病毒過表達載體和重組干擾腺病毒載體，并獲得了對秦川牛前體脂肪細胞Smad3有過表達能力的腺病毒AD-bSmad3和具有干擾能力的腺病毒AD-ShRNA-bSmad3，研究其對秦川牛前體脂肪細胞分化的調(diào)控作用，為進一步研究該基因和TGF-β信號通路在秦川牛脂肪組織生長發(fā)育過程中發(fā)揮的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

18月齡秦川牛的脂肪組織采自國家肉牛改良中心；pDC316-mCMV-EGFP、pDC316-EGFP-ShRNA載體質(zhì)粒、JM109感受態(tài)細胞、Polyfectine購自深圳百恩維生物科技有限公司；小量質(zhì)粒抽提試劑盒、Trans2K Plus II DNA Marker購自北京全式金生物公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自Omega公司；限制性內(nèi)切酶NotⅠ、NheⅠ，T4 DNA Ligase購自美國NEB公司；Qiagen大規(guī)模質(zhì)粒抽提試劑盒購自德國Qiagen公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清FBS、胰蛋白酶Trypsin 0.25% EDTA購自美國Invitrogen公司；青鏈霉素雙抗購自Gibco；ViraBind腺病毒純化試劑盒購自美國Cell Biolabs公司；SYBR Premix Ex Taq(Perfect Real Time)購自寶生物工程有限公司(TaKaRa)。

1.2 重組腺病毒載體的構(gòu)建

以秦川牛脂肪組織反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，根據(jù)GenBank公布的牛Smad3(GenBank accession NO.: NM_001205805)基因序列為參考，設計引物見表1，并在上、下游引物分別添加NheⅠ 和NotⅠ 酶切位點，用Fastpfupolymerase高保真酶擴增Smad3基因完整的CDS區(qū)，反應體系(50 μL)：DNA模板(100 ng·μL-1) 1 μL，F(xiàn)astpfupolymerase 1 μL，5× Fastpfubuffer 10 μL，dNTP Mix (2.5 mmol·L-1) 4 μL，上下游引物各(10 μmol·L-1)2 μL，ddH2O 30 μL。反應條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性20 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸75 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min；4 ℃冷卻10 min。膠回收酶切產(chǎn)物后再與穿梭質(zhì)粒pDC316-mCMV-EGFP連接，穿梭載體pDC316-mCMV-EGFP酶切體系(20 μL)：10×Buffer 2 μL，10×BSA 2 μL，NheI和NotI各1 μL，質(zhì)粒(500 ng·μL-1)2 μL，ddH2O 12 μL。目的基因bSmad3酶切體系(20 μL)：10×Buffer 2 μL，10×BSA 2 μL，NheI和NotI各1 μL，PCR回收產(chǎn)物10 μL，ddH2O 4 μL。連接體系(10 μL)：pDC316-mCMV-EGFP質(zhì)粒2 μL，bSMAD3 6.5 μL，10×DNA Ligase Buffer 1 μL，T4DNA Ligase 0.5 μL。用攜帶目的基因的重組質(zhì)粒pDC316-mCMV-EGFP-bSMAD3以及骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293A細胞，獲得攜帶目的基因Smad3的過表達腺病毒pDC316-EGFP-bSMAD3，標記為AD-bSMAD3；同時用重組質(zhì)粒pDC316-EGFP做對照組病毒，標記為AD-NC。

以牛Smad3(GenBank accession NO.:NM_001205805)基因序列為模板，應用shRNA在線設計軟件共設計3條特異shRNA，根據(jù)其靶向定位在Smad3基因CDS區(qū)的位置依次命名為shRNA-1247、shRNA-1405、shRNA-1486，經(jīng)退火復性后克隆入穿梭質(zhì)粒pDC316-EGFP-ShRNA 中。通過干擾效率檢測后，選擇pDC316-EGFP-ShRNA-bSMAD3-1405與骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293A細胞進行同源重組，獲得重組干擾腺病毒載體pDC316-EGFP-ShRNA-bSMAD3-1405，標記為AD-ShRNA-bSMAD3；同時用重組質(zhì)粒pDC316-EGFP-ShRNA做對照組病毒，標記為AD-ShRNA-NC。

表1PCR引物序列

Table1PrimersforPCR

基因Gene引物序列(5'→3')Primer sequence產(chǎn)物大小/bp LengthGenBank登錄號GenBank accession No.Smad3(CDS)F-CTAGCTAGCCACCATGTCGTCCATCCTGCCTTTCACR-ATTTGCGGCCGCCTACAGATCCTCTTCTGAGATGA-GTTTTTGTTCC1 332NM_001205805Smad3(ShRNA-1405)F-GCATGTGCACCATTCGCATGATTCAAGAGATC-ATGCGAATGGTGCACATGCTTTTTTAGATCTGR-GATCCAGATCTAAAAAAGCATGTGCACCATTCGC-ATGATCTCTTG-AATCATGCGAATGGTGCACATGC600NM_001205805

1.3 重組腺病毒的包裝、擴增及滴度測定

取鑒定好的重組病毒質(zhì)粒4 μg，用Polyfectine將目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到293A細胞,將細胞置于含5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中孵育4～6 h后換液。待細胞達到80%～90%融合后，傳代于25 cm2細胞培養(yǎng)瓶中，每天觀察，待細胞達到80%～90%融合后，傳代于75 cm2細胞培養(yǎng)瓶中，每天觀察出毒跡象，即細胞收縮變圓并伴隨有細胞脫落。待細胞大部分病變并從培養(yǎng)瓶壁脫落后，進行收毒，為病毒母液P1。用P1病毒上清感染293A細胞,發(fā)現(xiàn)細胞收縮變圓并伴隨有細胞脫落時收集細胞，-80 ℃/37 ℃反復凍融3次，10 000 g離心10 min收集病毒上清，標記為P2；用同樣的方法擴增病毒至P4代；用腺病毒純化試劑盒純化P4代病毒。用LaSRT法測定病毒滴度。

1.4 秦川牛前體脂肪細胞的培養(yǎng)及腺病毒感染細胞最佳MOI值測定

復蘇實驗室冷凍保存的秦川牛第1代前體脂肪細胞，經(jīng)傳代培養(yǎng)后，將細胞按1×104個·孔-1接種于兩個24孔培養(yǎng)板中。前體脂肪細胞的培養(yǎng)基為DMEM/F-12、10% FBS。分別加入不同劑量的腺病毒(感染復數(shù)(multiplicity of infection, MOI)分別為25、50、75、100、125和150)，每個處理設3個重復，48 h后根據(jù)細胞的生長情況及綠色熒光的表達情況來確定最佳的感染濃度。

1.5 腺病毒侵染秦川牛前體脂肪細胞

復蘇秦川牛第1代前體脂肪細胞，經(jīng)傳代培養(yǎng)到第3代時，將細胞按2×105個·孔-1接種于6孔培養(yǎng)板中，使用未誘導分化培養(yǎng)基(10%FBS+F12)培養(yǎng)。試驗共設計4個處理組：AD-bSMAD3、AD-NC、AD-ShRNA-bSMAD3、AD-ShRNA-NC。待前體脂肪細胞匯合度達到90%時，按照MOI值添加腺病毒原液，12 h后換成脂肪細胞誘導分化培養(yǎng)基(0.25 mmol·L-1IBMX、1 μmol·L-1地塞米松和5 μg·mL-1胰島素)的完全培養(yǎng)液；2 d后，撤去IBMX和地塞米松，使完全培養(yǎng)液中只含有5 μg·mL-1胰島素；再2 d后換成脂肪細胞完全培養(yǎng)基，每2 d換液1次。分別在培養(yǎng)的第0、3、6、9天時收集細胞，提取RNA并進行油紅O染色。

1.6 秦川脂肪細胞油紅O染色

從培養(yǎng)箱中取出侵染腺病毒6 d的脂肪細胞，先棄去培養(yǎng)基，用PBS洗3次，再用4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS清洗3次。用油紅O工作液(0.5 g的油紅O染液，加入100 mL的異丙醇，37 ℃振蕩混勻過夜為原液，使用時按照雙蒸水與原液比例為2∶3的比例進行稀釋并過濾)在室溫下浸染細胞30 min，PBS清洗3次；在顯微鏡下觀察照相。

1.7 實時熒光定量PCR檢測基因的表達

用Trizol試劑提取轉(zhuǎn)染Smad3基因第0、3、6、9天的前體脂肪細胞總RNA。各取1 μg RNA，按TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，利用ABI7500實時熒光定量PCR儀使用SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒進行實時定量PCR，反應總體系為20 μL。檢測Smad3基因及成肌和成脂相關(guān)基因的表達。定量引物相關(guān)參數(shù)見表2。反應體系(20 μL)：2 × SYBR Premix Ex Taq Mix 10 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.8 μL，cDNA(<100 ng)2 μL，ROX Reference Dye II (50×Conc.) 0.4 μL，ddH2O 6 μL。反應條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性12 s，60 ℃退火34 s，40個循環(huán)；95 ℃預變性30 s；95 ℃變性3 s，60 ℃退火30 s，40個循環(huán)。

表2定量引物序列

Table2PrimersforReal-timePCR

基因Gene引物序列(5'→3')Primer sequence產(chǎn)物/bpLengthGenBank登錄號GenBank accession No.Smad3F-AGCTGACACGGAGGCATATCR-CAGTTGGGAGACTGCACAAA109NM_001205805PPARγF-GAGATCACAGAGTACGCCAAGR-GGGCTCCATAAAGTCACCAA216NM_181024FABP4F-TGAGATTTCCTTCAAATTTGGGR-CTTGTACCAGAGCACCTTCATC101NM_174314C/EBPαF-ATCTGCGAACACGAGACGR-CCAGGAACTCGTCGTTGAA73NM_176784C/EBPβF-TTCCTCTCCGACCTCTTCTCR-CCAGACTCACGTAGCCGTACT79NM_176788GAPDHF-CCAACGTGTCTGTTGTGGATR-CTGCTTCACCACCTTCTTGA80NM_001034034β-actinF-CATCGGCAATGAGCGGTTCCR-ACCGTGTTGGCGTAGAGGTC147NM_173979.3

1.8 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)以“平均值±標準誤(mean±SE)”表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件One-way ANOVA進行方差分析，用t檢驗(t-test)對不同試驗處理之間的差異進行顯著性分析。*表示P<0.05，**表示P<0.01,***表示P<0.001。

2 結(jié) 果

2.1 秦川牛Smad3基因過表達腺病毒載體的構(gòu)建

以脂肪組織cDNA為模板，設計Smad3基因PCR引物擴增CDS全長，瓊脂糖電泳結(jié)果顯示，其目的條帶單一，大小為1 332 bp(圖1A)。瓊脂糖凝膠回收目的片段與pDC316-mCMV-EGFP連接，構(gòu)建Smad3基因過表達腺病毒載體pDC316-mCMV-EGFP-bSMAD3，用NheI和NotI雙酶切檢測并測序，雙酶切得到2條條帶，大小分別是1 332和5 885 bp(圖1B)。同時測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本試驗得到的秦川牛Smad3基因序列與GenBank收錄序列一致，證明過表達腺病毒載體pDC316-mCMV-EGFP-bSMAD3構(gòu)建成功。

2.2 秦川牛Smad3基因干擾腺病毒載體的構(gòu)建

shRNA-1247、shRNA-1405、shRNA-1486經(jīng)退火復性后克隆入穿梭質(zhì)粒pDC316-EGFP-ShRNA中。通過在HEK293A細胞中干擾效率檢測后，結(jié)果表明，pENTR/CMV-GFP/U6-1247、pENTR/CMV-GFP/U6-1405和pENTR/CMV-GFP/U6-1486均具有干擾效果，干擾效率分別為76.9%、83.3%、78.3%，其中pENTR/CMV-GFP/U6-1405的干擾效果相對較好(圖2A)，因此選擇shRNA-1405作為

最終使用的干擾序列，并構(gòu)建重組腺病毒干擾載體pDC316-EGFP-ShRNA-bSMAD3-1405。用BglⅡ做酶切鑒定，在載體骨架上含有一個BglⅡ酶切位點，結(jié)合片段上的BglⅡ位點可切出600 bp的條帶(圖2B)。

M1. DL2000相對分子質(zhì)量標準；M2. Trans2K plus marker DNA相對分子質(zhì)量標準；1. PCR擴增秦川牛Smad3基因產(chǎn)物；2. pDC316-mCMV-EGFP-bSMAD3質(zhì)粒Nhe Ⅰ和Not Ⅰ雙酶切鑒定結(jié)果M1. DL2000 marker； M2. Trans2K plus marker; 1. Agarose gel electrophoresis of Smad3 gene PCR products; 2. Digestion identification of pDC316-mCMV-EGFP-bSMAD3 plasmid by Nhe Ⅰ and Not Ⅰ圖1 Smad3基因克隆及pDC316-mCMV-EGFP-bSMAD3質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.1 Cloning of Smad3 gene and enzyme digestion identification of pDC316-mCMV-EGFP-bSMAD3

A. Smad3有效干擾shRNA序列的篩選(干擾效率為76.9%、83.3%、78.3%，**表示P<0.01)；B. pDC316-EGFP-ShRNA-bSMAD3-1405質(zhì)粒Bgl Ⅱ酶切鑒定：M. Trans2K plus marker DNA相對分子質(zhì)量標準；1. pDC316-EGFP-ShRNA-bSMAD3-1405質(zhì)粒Bgl Ⅱ酶切鑒定結(jié)果A. Inhibitive efficiency of Smad3 selective shRNA(Inhibitive efficiency is 76.9%, 83.3%, 78.3%; ** indicate P<0.01); B. Digestion identification of pDC316-EGFP-ShRNA-bSMAD3-1405 plasmid by Bgl Ⅱ: M. Trans2K plus marker； 1. The result of digestion identification of pDC316-EGFP-ShRNA-bSMAD3-1405 plasmid by Bgl Ⅱ圖2 Smad3基因干擾腺病毒載體的構(gòu)建Fig.2 The construction of Smad3 shRNA adenovirus vectors

2.3 重組腺病毒的包裝、擴增及滴度測定

用攜帶目的基因的重組質(zhì)粒pDC316-mCMV-EGFP-bSMAD3以及骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293A細胞1 d后即可觀察到綠色熒光；9 d后綠色熒光蛋白的表達量增多，并開始聚集形成彗星狀，12 d后大部分細胞出現(xiàn)病變效應并從培養(yǎng)瓶壁脫落，此時收集的病毒即為病毒母液P1(圖3A～3C和4A～4C)。第3代純化后的腺病毒感染細胞僅24 h，就有約50%的細胞出現(xiàn)病變現(xiàn)象，此時收集的病毒即為具有較高滴度的第4代腺病毒(圖3D和4 D)。采用LaSRT法測定滴度時，24 h后在顯微鏡下觀察細胞的綠色熒光蛋白(圖3E和4 E)，計算出腺病毒的滴度均為1×1010PFU·mL-1。用同種方法得到AD-NC、AD-ShRNA-bSMAD3、AD-ShRNA-NC的腺病毒滴度均為1×1010PFU·mL-1。

A.病毒重組子轉(zhuǎn)染HEK293A細胞24 h綠色熒光情況觀察；B.轉(zhuǎn)染9 d綠色熒光形成彗星狀的熒光聚集現(xiàn)象；C.轉(zhuǎn)染12 d綠色熒光變亮并鋪滿整個視野，大量細胞變圓脫壁，形成空斑；D.高滴度病毒侵染HEK293A細胞24 h綠色熒光分布情況；E.病毒原液分別稀釋102、103、104、105、106、107、108、109倍A. Fluorescence microscopic image of HEK293A cells transfected after 24 h; B. Fluorescence microscopic image after 9 d adenovirus transfection; C. Cytopathic effect (CPE) after 12 d adenovirus transfection; D. Fluorescence microscopic image after high titer adenovirus transfection for 24 h; E. The virus was diluted 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108 and 109 times圖3 過表達重組腺病毒的包裝及病毒滴度測定Fig.3 Overexpression recombinant adenovirus packaging and their titer determining

2.4 秦川牛前體脂肪細胞的培養(yǎng)及腺病毒感染細胞最佳MOI值測定

復蘇的秦川牛前體脂肪細胞經(jīng)1周的傳代培養(yǎng)后所得到的第3代細胞的形態(tài)大多數(shù)呈短梭形或多角形，細胞核呈圓形或橢圓形。將其接種于24 孔培養(yǎng)板中，并分別感染不同劑量的腺病毒。經(jīng)48 h后觀察發(fā)現(xiàn)，AD-bSMAD3、AD-NC、AD-ShRNA-bSMAD3、AD-ShRNA-NC的感染復數(shù)(multiplicity of infection, MOI)分別為100、25、100、50時效果最好(圖5A～5D)，此時細胞未出現(xiàn)明顯的病變效應且綠色熒光表達量較多，所以確定此濃度為最佳感染濃度。

2.5 秦川牛前體脂肪細胞Smad3基因的過表達效率和干擾效率檢測

高滴度過表達和干擾腺病毒侵染牛前體脂肪細胞3、6、9天時，熒光顯微鏡下都可以觀察到有95%以上的細胞能成功表達綠色熒光蛋白。分別提取RNA，通過qRT-PCR試驗發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，Smad3基因表達量分別上調(diào)了1 031倍、1 286倍、633倍(圖6A)和分別下調(diào)了70%、55%、57%(圖6B)。這些結(jié)果表明，Smad3腺病毒過表達和干擾載體構(gòu)建成功，為開展Smad3基因調(diào)控牛前體脂肪細胞的功能鑒定奠定了基礎。

A.病毒重組子轉(zhuǎn)染HEK293A細胞24 h綠色熒光情況觀察；B. 轉(zhuǎn)染9 d綠色熒光形成彗星狀的熒光聚集現(xiàn)象；C.轉(zhuǎn)染12 d綠色熒光變亮并鋪滿整個視野，大量細胞變圓脫壁，形成空斑；D.高滴度病毒侵染HEK293A細胞24 h綠色熒光分布情況；E.病毒原液分別稀釋102、103、104、105、106、107、108、109倍A. Fluorescence microscopic image of HEK293A cells transfected after 24 h; B. Fluorescence microscopic image after 9 d adenovirus transfection; C. CPE after 12 d adenovirus transfection; D. Fluorescence microscopic image after high titer adenovirus transfection for 24 h; E. The virus was diluted 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108 and 109 times圖4 干擾重組腺病毒的包裝及病毒滴度測定Fig.4 Interference recombinant adenovirus packaging and their titer determining

A. MOI值為100時感染AD-bSMAD3的牛前體脂肪細胞; B. MOI值為25時感染AD-NC的牛前體脂肪細胞; C. MOI值為100時感染AD-ShRNA-bSMAD3的牛前體脂肪細胞; D. MOI值為50時感染AD-ShRNA-NC的牛前體脂肪細胞A. MOI value is 100, Qinchuan cattle preadipocytes infected by AD-bSMAD3; B. MOI value is 25, Qinchuan cattle preadipocytes infected by AD-NC; C. MOI value is 100, Qinchuan cattle preadipocytes infected by AD-ShRNA-bSMAD3; D. MOI value is 50, Qinchuan cattle preadipocytes infected by AD-ShRNA-NC圖5 Smad3基因重組腺病毒侵染秦川牛前體脂肪細胞最佳MOI值測定Fig.5 Qinchuan cattle preadipocytes infected by Smad3 recombinant adenovirus with the optimal MOI value

2.6 Smad3基因抑制秦川牛前體脂肪細胞分化

腺病毒侵染牛前體脂肪細胞后，收集成脂誘導分化第6天的細胞，進行油紅O染色。對脂質(zhì)聚集觀察發(fā)現(xiàn)，AD-bSMAD3處理組明顯的減少了脂滴積累，而AD-ShRNA-bSMAD3處理組的脂滴積累則明顯增加(圖7A)。同時，qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，與AD-NC組相比，AD-bSMAD3處理組的成脂標志基

因PPARγ、FABP4、C/EBPα和C/EBPβ的 mRNA水平均顯著地下調(diào),相反地，與AD-ShRNA-NC組相比，AD-ShRNA-bSMAD3處理組的成脂標志基因PPARγ、FABP4、C/EBPα和C/EBPβ的mRNA水平均顯著地上調(diào)(圖7B)。結(jié)果表明，Smad3基因能夠顯著的抑制秦川牛前體脂肪細胞的分化。

A. Smad3基因過表達效率檢測；B. Smad3基因干擾效率檢測。不同處理間，**表示P<0.01, ***表示P<0.001，下圖同A. The overexpression efficiency Smad3 gene; B. The interference efficiency of Smad3 gene. Between different treatments: **. P < 0.01, ***. P<0.001, the same as the following figure圖6 Smad3基因過表達效率和干擾效率檢測Fig.6 Detection of overexpression and interference efficiency of Smad3 gene

A.秦川牛前體脂肪細胞在侵染AD-bSMAD3、AD-NC、AD-ShRNA-bSMAD3、AD-ShRNA-NC后，誘導分化6天，油紅O染色圖；B. 成脂標記基因PPARγ、FABP4、C/EBPα和C/EBPβ的表達檢測A. Oil Red O staining for day 6 Qinchuan cattle preadipocyte infected by AD-bSMAD3, AD-NC, AD-ShRNA-bSMAD3, AD-ShRNA-NC； B. Detection of PPARγ, FABP4, C/EBPα and C/EBPβ expression圖7 腺病毒介導Smad3基因調(diào)控秦川牛前體脂肪細胞分化Fig.7 Smad3 gene regulating the Qinchuan cattle preadipocyte differentiation mediated by adenovirus

3 討 論

肌內(nèi)脂肪的分布和含量決定了大理石花紋豐度，而大理石花紋的豐度是衡量牛肉品質(zhì)的重要指標。動物體內(nèi)，脂肪組織的沉積以及脂質(zhì)的合成主要是由脂肪細胞數(shù)量增多以及體積的不斷增大決定的[14]。目前已經(jīng)證實，TGF-β超家族成員在脂肪細胞分化和誘導中對脂滴合成與沉積起到關(guān)鍵的調(diào)控作用[15-16]。而在TGF-β信號通路中，Smad3蛋白起到至關(guān)重要的作用，它們能將信號由細胞膜轉(zhuǎn)至細胞核中從而調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄，是TGF-β家族的直接作用底物[17-18]。秦川牛的Smad3基因定位于10號染色體上，CDS區(qū)全長1 278 bp，編碼了425個氨基酸。本試驗利用秦川牛脂肪組織反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板在高保真酶的作用下成功克隆得到秦川牛Smad3基因序列。由于腺病毒載體產(chǎn)生的病毒顆粒比較穩(wěn)定，能有效地將外源基因轉(zhuǎn)染到各種靶細胞或組織中，病毒的包裝容易，且滴度易于提高，并且不會對人的身體健康產(chǎn)生影響，這使得腺病毒成為細胞試驗中最常用的病毒載體之一，成為表達和傳遞治療基因的主要候選者[19-20]。為了更好地研究Smad3基因在秦川牛脂肪的生長發(fā)育過程中起到的調(diào)控作用，選擇利用腺病毒的侵染性以實現(xiàn)目的基因Smad3在真核細胞的過表達和干擾。本試驗采用Ad5腺病毒改造的AdMaxTM重組腺病毒包裝系統(tǒng)，與前期使用的腺病毒載體系統(tǒng)ViraPowerTMAdenoviral Expression System及AdEasyTMAdenoviral Vector System不同，只需要連接穿梭載體然后在重組酶的作用下進行細胞內(nèi)重組，而且包裝過程需要不斷傳代，但是獲得的腺病毒滴度和侵染效率均較高[21-23]。相同點是，與脂質(zhì)體等介導的化學試劑轉(zhuǎn)染法，應用電轉(zhuǎn)移、核轉(zhuǎn)移等物理方法比較，這幾種腺病毒載體都能最大限度的保護細胞不受損傷，還能使細胞保持良好的生長狀態(tài)[24-25]。本研究最后選擇了試驗中所得到的4代過表達腺病毒，其滴度可以達到1×1010pfu·mL-1。按MOI值侵染秦川牛前體脂肪細胞3、6、9 d后，與Ad-NC對照組相比，牛成肌細胞中Smad3基因的表達量顯著上調(diào)了1 031、1 286、633倍(P<0.001)。同樣用所得到的4代腺病毒干擾病毒AD-ShRNA-bSMAD3，與AD-ShRNA-NC對照組相比，Smad3基因的表達量分別下調(diào)了70%，55%，57%(P<0.01)。說明腺病毒AD-bSMAD3和AD-ShRNA-bSMAD3具有很好的過表達和干擾效果，為下一步研究Smad3基因在成脂分化過程中的作用奠定了基礎。

脂肪的生長發(fā)育是依賴于多種信號通路和轉(zhuǎn)錄因子相互作用的級聯(lián)反應。有一些促進脂肪生成的因素，如在成脂發(fā)生的早期階段，C/EBPβ(CCAAT enhancer binding proteinsβ)顯著上調(diào)，然后激活了C/EBPα(CCAAT enhancer binding proteinsα)和PPARγ表達；C/EBPα和PPARγ互相調(diào)控進一步激活了下游成脂基因FABP4(fatty acid binding protein 4)和FASN(fatty acid synthase)的表達，進而促進了成熟脂肪的形成[26-28]。有研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β超家族配體在前體脂肪細胞向成熟脂肪細胞的分化過程中起著十分重要的作用，但其在脂肪形成過程中的詳細功能至今也不是很清楚。研究表明，TGF-β在肥胖的模式動物和人體內(nèi)高表達，在脂肪細胞中脂肪的形成過程中會被Smad3抑制[12-13]。而在Smad3缺失的小鼠體內(nèi)，飲食誘導的肥胖會被抵制,并且這些小鼠的脂肪形成能力會顯著降低[29-30]。也就是說TGF-β信號通路對脂肪的調(diào)控在體內(nèi)和體外的研究結(jié)果是相互矛盾的，其具體調(diào)控機制有待進一步的驗證。有研究表明，TGF-β信號通路抑制脂肪的生成有一部分依賴于Smad3信號通路。Smad3被TGF-β激活后，與C/EBPβ和C/EBPδ(CCAAT enhancer binding proteinsδ)結(jié)合，抑制他們的轉(zhuǎn)錄活動，這反過來導致了PPARγ轉(zhuǎn)錄的減少，是脂肪生成的主要調(diào)節(jié)劑，從而抑制了脂肪生成的過程[31]。然而，也有報道證明，TGF-β信號通路抑制脂肪的生成也可以不依賴于Smad3基因[32]。為了進一步研究Smad3基因的調(diào)控機制，本試驗利用前期獲得的高滴度腺病毒侵染秦川牛前體脂肪細胞，由油紅O染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達Smad3基因后能夠抑制細胞中脂滴的沉積，相反地，干擾Smad3基因后，能夠促進細胞中脂滴的形成。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，Smad3基因顯著的下調(diào)了成脂基因C/EBPβ、C/EBPα、PPARγ和FABP4的表達。這些結(jié)果初步證明，Smad3可能參與了脂肪生成的早期調(diào)控，是調(diào)控秦川牛前體脂肪細胞分化的一個負向調(diào)控因子。而Smad3基因?qū)/EBPβ、C/EBPα、PPARγ和FABP4基因是直接調(diào)控作用還是間接調(diào)控作用需要進一步探討研究。

4 結(jié) 論

本研究成功獲得了秦川牛Smad3基因的過表達和干擾重組腺病毒。研究表明，Smad3基因抑制秦川牛前體脂肪細胞分化及成脂關(guān)鍵基因的表達，這為進一步探索TGF-β信號通路調(diào)控脂肪形成的分子機制奠定了基礎。