趙寶平 葉川 江深河 武成興 謝大偉 李江龍 劉志偉 許明友 付紅軍

摘 要：目的 比較骨不連患者采用組織工程干細胞聯(lián)合PRP和常規(guī)開放固定+有效植骨治療的臨床療效。方法 將骨不連患者43例分為治療組22例和對照組21例，治療組患者采用組織工程化干細胞聯(lián)合PRP移植治療，對照組采用開放內(nèi)固定+有效植骨治療。比較患者兩組手術(shù)時間、出血量、住院費用、住院時間、切口愈合等級、有無取自體骨等相關(guān)指標。結(jié)果 隨訪9～15個月后，治療組骨折愈合率為86.36%，對照組骨折愈合率為85.70%，組間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；在手術(shù)時間、出血量、住院費用、住院時間方面，對照組均高于治療組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；切口愈合方面，對照組有2例患者出現(xiàn)Ⅱ級愈合，治療組患者均為Ⅰ級愈合；有無取自體骨：治療組無一例取自體骨，對照組均取自體骨。結(jié)論 組織工程化干細胞聯(lián)合PRP可作為一種有效的治療骨不連的方法，較常規(guī)手術(shù)方法更微創(chuàng)，操作更簡便，損傷小，節(jié)約經(jīng)濟，減少住院時間，未來可作為治療骨不連的一種有效的方法。

關(guān)鍵詞：組織工程；間充質(zhì)干細胞；富含血小板血漿；骨不連

中圖分類號：R687.3 文獻標識碼：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.12.020

文章編號：1006-1959（2018）12-0065-04

Abstract：Objective To compare the clinical efficacy of tissue-engineered stem cells combined with PRP and conventional open fixation+effective bone grafting in patients with non-union.Methods 43 patients with nonunion were divided into treatment group（22 cases）and control group（21 cases）.The treatment group patients were treated with tissue-engineered stem cells combined with PRP transplantation，and the control group was treated with open internal fixation+effective bone grafting.The two groups of patients were compared for operative time，blood loss，hospitalization costs，length of stay，incision healing grade，and whether autologous bone was taken or not.Results After 9 to 15 months of follow-up，the fracture healing rate was 86.36% in the treatment group and 85.70% in the control group.There was no significant difference between the two groups（P>0.05）；The operative time，blood loss，hospitalization costs，and length of hospital stay were higher in the control group than in the treatment group，the difference was statistically significant （P<0.05）.In wound healing，two patients in the control group had grade II healing，and all patients in the treatment group had grade I healing；Whether or not autologous bone was taken：No autologous bone was used in the treatment group，and autologous bone was used in the control group.Conclusion Tissue-engineered stem cells combined with PRP can be used as an effective method for the treatment of bone non-union，which is more minimally invasive，easier to operate，less damaged，economical，and less time spent in hospital.The future can be used as an effective treatment for non-union.

Key words：Tissue-engineered；Mesenchymal stem cells；Platelet-rich plasma；Non-union

骨不連一直以來是困擾骨科醫(yī)師的難題[1]，臨床上常見的方法是開放手術(shù)，取自體骨或同時更換內(nèi)固定方式[2]，因其手術(shù)創(chuàng)傷較大，出血較多，費用高，取自體骨骨副損傷等，一直不被患者所接受。近年來隨著干細胞、生物材料學及組織工程技術(shù)的發(fā)展，使干細胞和PRP（platelet-rich plasma）移植治療骨不連的研究逐漸成為骨科領(lǐng)域研究的熱點[3]。既往都采用單一方法治療骨不連，效果較好但仍存在失敗病例，間充質(zhì)干細胞具有向成骨細胞分化的能力、PRP中的TGF因子家族有促進干細胞成骨轉(zhuǎn)化和局部血管化的生物學效應(yīng)，如能聯(lián)合二者對骨不連進行治療，理論上有增加療效的功能，且在本研究中我們使血漿成分凝膠化，使血漿轉(zhuǎn)換為可吸收生物材料而負載干細胞和PRP中的生長因子成分，形成組織工程化干細胞-PRP凝膠，避免了局部注入的干細胞和PRP流失的弊端，固化和增加了二者在局部發(fā)揮更大的生物學效應(yīng)，文章總結(jié)興義市人民醫(yī)院骨創(chuàng)傷科近4年來組織工程化干細胞聯(lián)合PRP治療骨不連的手術(shù)，比較了兩種手術(shù)的臨床療效及相關(guān)指標。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集興義市人民醫(yī)院于2013年3月～2017年6月因骨不連行手術(shù)治療的患者43例，本實驗采用非隨機同期對比觀察，已獲得興義市人民醫(yī)院倫理委員會的批準。根據(jù)手術(shù)方法將所有患者分為治療組和對照組。治療組22例，男17例，女5例，年齡19～65歲，平均年齡（42.50±1.11）歲；BMI 20.20～25.11 kg/m2，平均BMI（24.30±1.01）kg/m2。對照組21例，男16例，女5例，年齡20～57歲，平均年齡（40.50±1.11）歲；BMI 21.61～26.30 kg/m2，平均BMI（23.66±1.01）kg/m2。兩組患者性別、年齡、BMI等一般資料相比，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），具有可比性。

1.2診斷、納入和排除標準

1.2.1診斷標準 參照文獻[4]，根據(jù)患者的臨床及影像學指標診斷骨不連。

1.2.2納入標準 ①符合診斷標準；②排除感染性骨不連；③患者同意行該手術(shù)方案。

1.2.3排除標準 ①感染性骨不連；②下肢血管性疾?。虎劬植科つw條件不允許[5]。

1.3方法

1.3.1材料 ①治療組：離心機（實驗室醫(yī)用離心機80-1），離心管（50 ml），凝血酶（500 U/支），穿刺針。②對照組：鎖定鈦板（北京富樂科技開發(fā)有限公司），髓內(nèi)釘（蘇州康力骨科器械有限公司），輔助工具為不銹鋼。

1.3.2術(shù)前準備 所有患者入院后行全面的體格檢查和輔助檢查，評估手術(shù)耐受情況，血壓控制在150/90 mmHg以下，血糖8.0 mmol以下，CRP 10 mg/L以下，ESR 20 mm/h以下。

1.3.3手術(shù)方法 治療組行組織工程化干細胞聯(lián)合PRP治療，原內(nèi)固定不更換。間充質(zhì)干細胞采集方法：重組人粒細胞集落刺激因子，予患者400 μg/d皮下注射，1次/d，連用4 d。檢查外周血白細胞計數(shù)，使外周血白細胞計數(shù)控制在（3～4）×1010/L。監(jiān)測白細胞變化，當白細胞升至平均20～250倍時，應(yīng)用血細胞分離機循環(huán)全省血液分離出濃度為（1～3）×1011/L的外周血干細胞懸液，離心待用。PRP采用二次離心分離技術(shù)，取中層血小板富集區(qū)待用[6]。同法取髂前上棘為穿刺點，抽取取骨髓血50 ml，應(yīng)用血細胞分離機分離出濃度為（1～3）×1011/L的骨髓干細胞懸液，離心待用。 干細胞懸液和PRP混合后共10 ml，混勻后加入凝血酶適量，按照（1 ml∶100 U），制成凝膠待用。根據(jù)患者骨不連的特征，對于肥大型的采用X線下定位穿刺骨折斷端，細小刮匙刮除創(chuàng)面硬化骨，多點注入骨折斷端，有效的外固定。對萎縮性骨不連及滑膜性假關(guān)節(jié)采用小切口切開骨折斷端纖維清理，骨折復位后將制備好的凝膠樣物放入骨折斷端，關(guān)閉傷口，對骨折做有效的固定。

對照組行開放手術(shù)更換內(nèi)固定+自體骨植骨治療。取同側(cè)髂骨松質(zhì)骨適量備用，沿原切口進入，顯露清理骨折斷端，更換內(nèi)固定，將備用的松質(zhì)骨打壓植入骨折端，放置引流，關(guān)閉切口。手術(shù)后根據(jù)固定可靠程度及部位在患者可耐受情況下決定開始功能鍛煉時間。

1.3.4術(shù)后處理 術(shù)后預防性抗生素治療3 d，對照組中引流管24 h后拔除，出院1、3、6、12、15個月復查，根據(jù)復查結(jié)果指導功能鍛煉、負重和拆除內(nèi)固定時間。

1.4觀察指標 參照文獻[6]，根據(jù)患者的癥狀體征及影像學指標診斷骨愈合，根據(jù)骨折愈合標準統(tǒng)計骨折愈合率，手術(shù)時間（h），出血量（ml），住院費用（元），住院時間（d），切口愈合等級，有無取自體骨。

1.5統(tǒng)計學分析 采用SPSS12.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以（x±s）表示，組間數(shù)據(jù)差異的比較采用配對t檢驗，計數(shù)資料以（%）表示，比較采用？字2檢驗。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1兩組患者各項觀察指標比較 所有患者均獲得隨訪，隨訪6～15個月，治療組愈合率86.36%，有1例出現(xiàn)了骨延遲愈合，通過連續(xù)隨訪，12個月獲得了骨愈合。對照組骨折愈合率85.70%，組間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），在手術(shù)時間、出血量、住院費用、住院時間方面，對照組均高于治療組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表1；切口愈合方面，對照組有2例患者出現(xiàn)Ⅱ級愈合，治療組患者均為Ⅰ級愈合；有無取自體骨：治療組無一例取自體骨，對照組均取自體骨。

2.2典型病例 圖1中a、b、e、f為治療組術(shù)前骨不愈合的正側(cè)位片，c、d、j、k為采用組織工程化間充質(zhì)干細胞聯(lián)合PRP治療后6月正側(cè)位片，i、m為對照組術(shù)前的骨不愈合的正側(cè)位片，n、o為采用開放固定+有效植骨治療6個月后正側(cè)位片。

3 討論

從以上實驗我們可以看到，組織工程化干細胞聯(lián)合PRP在治療骨不連中有優(yōu)越的效果，在保證骨折愈合率的基礎(chǔ)上，較我們傳統(tǒng)手術(shù)創(chuàng)傷小，出血少，減少了住院時間及住院費用，減少取自體骨帶來的副損傷，傷口愈合好，是一種值得推廣的治療骨不連的方法。

骨不連通常被分為肥大性，骨膜性假關(guān)節(jié)，感染性，萎縮性骨不連等四種，肥大性骨不連局部血供較好，引起骨不連的原因主要是局部不穩(wěn)，影像學表現(xiàn)“象足征”或“抱球狀改變”。需牢固的內(nèi)固定一般可達到骨性愈合?；ば约訇P(guān)節(jié)是在骨折處形成一個充滿液體的滑囊腔，封閉了骨髓腔，打斷了遠近端骨的連接通路，感染性骨不連需采取感染病灶清除，植骨或行骨延長等方法治療。萎縮性骨不連表現(xiàn)為周圍瘢痕組織替代骨痂，骨折端血供或骨活性較差，有時表現(xiàn)為骨吸收[7，8]。骨不連有時不是單純的一種因素導致的，可能同時合并有好幾種。所以針對骨不連，在改善穩(wěn)定和血供的基礎(chǔ)上，改善成骨活性和增加骨愈合的能力會極大的改善骨不連的治愈成功率[9]。

骨不連的傳統(tǒng)治療方法為開放固定+有效的植骨，此有效的植骨多選擇自體骨，自體骨有良好的支撐性及骨誘導性，同時有骨髓細胞，因而成骨效果好，是良好的植骨材料，但因自體骨數(shù)量有限，增加創(chuàng)傷，增加手術(shù)時間及并發(fā)癥風險，尤其不適用兒童及年老體弱者[10]。傳統(tǒng)的開放手術(shù)切口大，失血多，增加感染風險，延長了住院時間及住院費用。隨著分子生物學及組織工程學的發(fā)展，有沒有一種更有效、更微創(chuàng)、更節(jié)約的一種治療骨不連的方法呢？組織工程化間充質(zhì)干細胞、PRP的研究給我們帶來了希望。國內(nèi)外文獻表明，臨床在治療骨不連方面取得了不錯的效果[11]，但都僅限于一種方法治療骨不連。我們將兩種方法聯(lián)用，取得了不錯的療效。從理論上分析，外周血干細胞和骨髓干細胞來源于中胚層，具有多項分化的潛能，在特定的理化條件與細胞因子誘導下，可定向的向成骨細胞方向轉(zhuǎn)化[12]。PRP是在血小板裂解同時釋放大量細胞因子，細胞因子可誘導干細胞向成骨細胞轉(zhuǎn)化[13]和促進組織血管化，所以干細胞有效的解決了成骨種子細胞的問題，PRP促進了骨誘導及加速成骨問題，同時PRP裂解產(chǎn)生的細胞因子可促使白細胞向局部轉(zhuǎn)移，加強了局部的抗感染性，有效的防止傷口感染[14]。

干細胞或PRP治療都存在不能有效固化在治療部位和活性成分流失的問題，在本研究中，我們加入凝血酶從而使血漿中的纖維蛋白原形成纖維蛋白凝膠，形成自體組織工程支架材料使干細胞和細胞因子固化在骨折斷端，避免了流失，為干細胞成骨提供一定的支撐，促使其向成骨細胞轉(zhuǎn)化的過程，同時凝血酶還可迅速裂解血小板，使血小板中的細胞因子大量釋放，進一步促進修復效應(yīng)。

雖然組織工程化干細胞及PRP在治療骨不連方面有巨大的潛力，但還有一些問題需要進一步研究[15]。①本研究中的干細胞為體內(nèi)動員，而更大量的間質(zhì)干細胞獲取有待于體外擴增和培養(yǎng)，對技術(shù)要求較高，且目前僅限于臨床研究階段，但貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院已是首批國家衛(wèi)計委和藥監(jiān)局批準的干細胞臨床研究機構(gòu)，后續(xù)研究正在申請備案并開展；②組織工程化干細胞誘導、與可吸收生物材料的符合構(gòu)建還需進一步的研究；③PRP釋放的細胞因子數(shù)量，種類巨多，在細胞因子分類及作用機理研究方面還有待深入研究。

總之，造成骨不連的因素不只是單純的一種因素，在治療骨不連時，有效的固定，良好的血運，作為種子細胞向成骨細胞轉(zhuǎn)化的干細胞，加速干細胞向成骨細胞轉(zhuǎn)化的PRP都是治療骨不連的確切有效的方法。只有在滿足這些條件的情況下，才會大大提高骨不連的治療效果。

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收稿日期：2018-3-20；修回日期：2018-3-30

編輯/成森