方炳雄 陳漢強 秦澤鴻 蔡潔娜 張俊賢 翁文婕 黃瓊儀

1.廣東省普寧市人民醫(yī)院檢驗科，廣東普寧 515300；2.廣東省普寧市人民醫(yī)院皮膚性病科，廣東普寧 515300

人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）具有嗜上皮細(xì)胞性，可導(dǎo)致人皮膚黏膜多種良性和惡性疾病[1]。至今，已發(fā)現(xiàn)HPV型別有100多種，常見20多種亞型，國際癌癥研究協(xié)會根據(jù)HPV致病的強弱，分為低危型和高危型兩大類型，低危型與性傳播性尖銳濕疣（condyloma acuminatum，CA）有關(guān)，高危型是宮頸癌的主要致病因素[2]。尖銳濕疣是由于患者感染人乳頭瘤病毒，引起生殖器及周邊黏膜的良性增生損害，出現(xiàn)疣體增生的一種性傳播疾?。╯exually transmitted diseases，STD）[3-4]。男性CA感染率較高，是僅次于淋病的第二大性傳播疾病，目前關(guān)注的重點是女性的HPV感染情況，而對男性HPV感染研究較少[5-6]。對男性HPV感染者實行有效的篩查和預(yù)防管理，有利于減少通過性傳播感染女性。

本課題收集2016年1月～ 2017年12月間，在我院皮膚性病科就診的551例男性尖銳濕疣患者的標(biāo)本，采用PCR及導(dǎo)流雜交芯片技術(shù)，檢測男性CA患者HPV 21種常見亞型的感染情況，分析其型別特點?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 臨床樣品

以年份為單位進(jìn)行分群，采用整群抽樣的統(tǒng)計抽樣方法，抽取2016年和2017年兩年期間的所有患者信息進(jìn)行分析。2016年1月～ 2017年12月間，我院皮膚性病科就診的尖銳濕疣男性患者，按照自愿自由原則納入研究范疇。納入標(biāo)準(zhǔn)：有典型皮疹的尖銳濕疣患者；皮疹不明顯，但醋酸白試驗陽性的患者；主治醫(yī)師根據(jù)臨床特征，懷疑尖銳濕疣的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：患者拒絕參與；有HPV疫苗接種史；有HIV、梅毒螺旋體感染等；臨床資料不齊。

臨床樣品來自符合本課題納入標(biāo)準(zhǔn)的551例男性患者，采取疣體皮損部位脫落細(xì)胞或尿道脫落細(xì)胞。疣體樣本使用專用手術(shù)剪刀，剪下疣體組織或使用棉拭子，反復(fù)摩擦疣體直至出血，把組織或棉拭子放入盛有細(xì)胞保存液的采樣管中。尿道脫落細(xì)胞采集方法：用細(xì)小棉拭子伸入尿道2～5cm，擰動拭子兩圈，采集到尿道脫落細(xì)胞，將其放入專用采樣管中。551例男性患者中，疣體標(biāo)本有213例，尿道脫落細(xì)胞有307例，其他標(biāo)本類型有31例。不同年齡段患者，人數(shù)不一，其中以20～40歲年齡段患者為主，有428例，占77.68%；≤20歲年齡段患者有34例；40～50歲年齡段患者有58例；＞50歲年齡段患者有31例；研究對象平均年齡（31.7±10.4）歲。本課題研究通過醫(yī)院的倫理委員會審批同意。

1.2 實驗方法與設(shè)備

使用廣東凱普生物科技有限公司提供的DNA提取試劑盒，提取標(biāo)本中HPV DNA；使用杭州生物技術(shù)有限公司提供的ETC811-384定性PCR儀，進(jìn)行目標(biāo)基因的擴增；使用廣東凱普生物科技有限公司提供的雜交試劑盒和核酸分子快速導(dǎo)流雜交儀，檢測HPV 21種亞型，分別為低危型：6、11、42、43、44和 CP8304亞型；高危型：16、18、31、33、35、39、45、51、53、56、52、58、59、66和68亞型。

1.3 HPV DNA分離提取及亞型檢測

按照檢測試劑的說明書的步驟，分為以下四個步驟，進(jìn)行HPV DNA分離提取及分型檢測。

（1）DNA分 離 提 ?。杭?入 800μL標(biāo) 本，14000rpm離心5min；去上清液，留沉淀，加入細(xì)胞裂解液，煮沸提取DNA；取1.0μL DNA溶液進(jìn)行PCR擴增。

（2）PCR擴增：按照以下程序進(jìn)行PCR擴增：95℃ 9 min預(yù)變性；然后→ 95℃ 20s，55℃ 30s，72℃ 30s，運行40個循環(huán)；→72℃ 5 min；→4℃保溫，待用。

（3）導(dǎo)流雜交：PCR產(chǎn)物經(jīng)過95℃變性5min，迅速放入冰水盒中2min，用于雜交。變性的PCR產(chǎn)物加入雜交孔中，45℃條件下雜交10min；依次加入封阻液、反應(yīng)酶，最后加入顯色液。

（4）結(jié)果判讀：陽性孔為藍(lán)紫色，室內(nèi)質(zhì)量控制在控的情況下，先判讀樣本的兩個質(zhì)控孔，再判讀其他檢測情況。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS19.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以（±s）表示，采用t檢驗，計數(shù)資料以百分?jǐn)?shù)（%）表示，采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 男性CA患者HPV各亞型分布情況

本課題研究的551例男性尖銳濕疣患者，其中252例患者HPV感染，陽性檢出率為45.74%，檢出率前五位的HPV亞型是：6亞型、11亞型、16亞型、51亞型和52亞型，分別為20.87%（115/551）、15.06%（83/551）、5.44%（30/551）、5.08%（28/551）和4.54%（25/551）。見表1。252例HPV陽性患者覆蓋21種亞型，存在多重感染情況，累計陽性孔數(shù)為431孔，其中以6亞型（26.68%，115/431）和11亞型（19.26%，83/431）為主，占 45.94%（198/431）。見圖1。

圖1 男性CA患者HPV各亞型別分布情況

表2 94例HPV多重感染患者的感染類型[n（%）]

表1 551例男性CA患者HPV各亞型陽性檢出率

2.2 男性CA患者HPV單一亞型與多重混合感染

在252例HPV陽性標(biāo)本中，158例為單一亞型感染，占62.70%（158/252），其中前三種亞型依次為：HPV6亞型（39.87%，63/158）、HPV11亞型（25.95%，41/158）、HPV16亞型（6.33%，10/158）。94例為多重感染，其中二重感染有50例（53.19%）；三重有22例（23.40%）；四重有10例（10.64%）；五重有8例（8.51%）；六重有3例（3.19%）；九重有1例（1.06%）。94例患者為多重感染，有78例為高危型和低危型混合感染，占82.98%（78/94），比單純低危型或單純高危型感染出現(xiàn)頻率高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

2.3 不同年齡段的男性CA患者HPV亞型檢測結(jié)果

551例男性CA患者中，不同年齡段患者人數(shù)不一，其中以20～40歲年齡段患者為主，占77.68%（428/551）。20～50歲年齡段患者多重感染率為15.64%（76/486）， 比其他年齡段患者多重感染率低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=5.888，P=0.015＜0.05）。＞50歲的年齡段患者的HPV陽性檢出率為70.97%（22/31），比其他年齡段患者陽性檢出率高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=8.427，P=0.004＜0.05）。見表3。

表3 不同年齡段男性CA患者HPV亞型檢測結(jié)果[n（%）]

3 討論

男性HPV感染與性傳播性疾病、不孕不育、生殖器腫瘤等因素有一定相關(guān)性，關(guān)注男性尖銳濕疣的HPV感染有助于男性生殖健康[6]。研究表明，大多數(shù)HPV隱形感染者可在2～3月發(fā)展為尖銳濕疣患者，而且HPV隱形感染者或尖銳濕疣患者，與性伴侶發(fā)生性關(guān)系后，傳播率大約65%[7]。女性HPV感染性與宮頸癌的關(guān)系是目前研究的重點，同時有些學(xué)者也在男性尖銳濕疣方面進(jìn)行研究，哈爾濱市醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科的趙方晴等[8]報道了HPV在尖銳濕疣感染情況、標(biāo)本采集方法和疫苗防治等方面內(nèi)容，介紹CA與HPV的相關(guān)性的研究進(jìn)展。

本課題研究發(fā)現(xiàn)，對皮膚性病科就診的551例男性尖銳濕疣患者，采用廣東凱普生物科技有限公司提供的DNA提取試劑盒和雜交試劑盒，進(jìn)行HPV 21種亞型檢測。檢測結(jié)果為252例患者HPV感染，陽性檢出率為45.74%。與董正蓉等[9]報道的廣東省珠三角地區(qū)男性尖銳濕疣的陽性檢出率：43.4%，相一致，比田欣欣等[10]報道的山東地區(qū)的男性尖銳濕疣的陽性檢出率：57.8%，偏低。不同地區(qū)男性尖銳濕疣陽性檢出率，存在一定的地域差異性。

本課題結(jié)果顯示，252例HPV陽性患者覆蓋21種亞型，其中以6亞型和11亞型為主，兩種亞型累計占45.94%，均比其他亞型陽性檢出率都高，與國內(nèi)外報道相似[7，9-11]。女生外陰尖銳濕疣組織HPV感染基因分型研究中，也發(fā)現(xiàn)以6亞型和11亞型為主[12]。英國大樣本量研究發(fā)現(xiàn)，HPV 6亞型和11亞型在尖銳濕疣的發(fā)病機制得到重要的作用[13]。HPV不同亞型在男性CA患者中，檢出率不同，其起到的作用也不一。本課題結(jié)果顯示，在252例HPV陽性標(biāo)本中，158例為單一亞型感染，占62.70%，以HPV 6、11和16亞型為主。94例為多重感染患者中，有78例為高低危型混合感染，占82.98%，比單純低危亞型或單純高危亞型感染出現(xiàn)頻率高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），與山東地區(qū)相關(guān)報道一致[10]。男性尖銳濕疣患者不論是單一亞型感染還是多重感染，其HPV都以6亞型和11亞型為主。這為以后男性HPV二價疫苗的研發(fā)和接種，提供科學(xué)依據(jù)。

不同年齡段男性尖銳濕疣患者的HPV感染情況各不相同，有報道[5，14]，青年男性感染率較高，可能存在原因，此年齡段的青年男性性活躍、性伴侶多，免疫系統(tǒng)未被致敏等因素，導(dǎo)致這些人群HPV感染率偏高。本課題研究結(jié)果，551例男性CA患者中，不同年齡段患者人數(shù)不一，其中以（20，40]歲年齡段患者為主，占77.68%， （20，30]、 （30，40] 和＞50歲年齡段患者陽性檢出率分別是46.08%、44.83%和70.97%。本課題研究的患者的青年HPV感染率與董正蓉等[9]研究的廣東省珠三角人群的感染率相似，同時發(fā)現(xiàn)＞50歲老年齡段患者是研究人群中感染率最高的。可能原因，本課題的納入對象，大部分來自廣東省潮汕男性人群，欠發(fā)達(dá)地區(qū)，老年人男性免疫力相對降低，而導(dǎo)致HPV感染率偏高。廣東省人民醫(yī)院林靜報道過：尖銳濕疣患者的細(xì)胞免疫水平與疾病復(fù)發(fā)存在密切關(guān)系，可通過提高機體免疫水平，有效地降低尖銳濕疣患者治療后復(fù)發(fā)[15]。中青年段（20～50歲）患者免疫水平相對較高，其多重感染率為15.64% ，比其他年齡段患者多重感染率低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。本課題不同年齡段男性CA患者的HPV感染率與其他報道不盡一致，其根本原因還得進(jìn)一步研究。

綜上所述，本地區(qū)男性尖銳濕疣患者以HPV 6亞型和11亞型感染為主，HPV感染患者中，以單一HPV亞型感染為主；多重感染患者中，以HPV高危型和低危型混合感染最為常見。研究結(jié)果可作為了解掌握本地區(qū)男性尖銳濕疣的HPV感染情況和型別特點的參考資料，以后男性HPV二價疫苗的研發(fā)和接種，提供科學(xué)依據(jù)。本課題是回顧性研究，并未將男性性生活、性伴侶、免疫水平等資料納入研究因素，存在一定的局限性，同時也為以后深入研究男性尖銳濕疣患者與HPV相關(guān)性提供前期基礎(chǔ)與課題方向。