邵凌東 彭清琴 唐黎瑞 張雪清 李金鑾 吳君心

福建醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 福建省腫瘤醫(yī)院放療科，福建福州 350014

胰腺癌約占所有腫瘤發(fā)病率的3.2%；然而，由于其很高的死亡率，患病者中約有80.3%發(fā)生腫瘤相關(guān)死亡[1]，在歐美發(fā)達(dá)國(guó)家腫瘤相關(guān)死亡中高居第4位[1-2]。目前，臨床上僅15% ～ 20%的確診患者可進(jìn)行手術(shù)切除治療，這使得胰腺癌的總體生存率很難提高。而這部分手術(shù)可切除的患者，中位生存時(shí)間僅為 15～23個(gè)月[3-4]，5年總生存＜20%[4]。通過(guò)聯(lián)合放射治療與化療提高胰腺癌的局部切除率、降低術(shù)后復(fù)發(fā)率并最終提高總生存率成為目前的研究熱點(diǎn)。研究表明[5]，在HIF-1ɑ表達(dá)較高的腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3中，使用HIF-1ɑ抑制劑YC-1，可明顯下調(diào)HIF-1ɑ的表達(dá)，并進(jìn)一步降低了血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）表達(dá)，從而抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡。這也揭示了HIF-1ɑ/VEGF可以作為抗腫瘤治療的重要靶點(diǎn)。目前國(guó)內(nèi)外尚缺少在胰腺癌中使用HIF-1ɑ/VEGF抑制劑的放射增敏研究。在本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)HIF-1ɑ的抑制劑YC-1抑制HIF-1ɑ的表達(dá)進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，觀察在輻射條件下胰腺癌MIA-Paca2細(xì)胞株的凋亡情況及對(duì)HIF-1ɑ和VEGF的表達(dá)水平的影響，為胰腺癌的放射增敏治療提供新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料及設(shè)備

人胰腺癌MIA-PaCa2細(xì)胞株由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)提供；YC-1購(gòu)自英國(guó)Tocris公司；細(xì)胞凋亡試劑盒AnnexinV/PI來(lái)自美國(guó)BD公司；鼠抗人HIF-1ɑ單克隆抗體（H1alpha67）、鼠抗人VEGF單克隆抗體（VG1）購(gòu)于美國(guó)Novus公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 人胰腺癌MIA PaCa-2細(xì)胞選用含10%胎牛血清（PANSera ES FBS）的DMEM高糖培養(yǎng)液，在含5%CO2（體積分?jǐn)?shù)），20%O2的37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待培養(yǎng)細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后進(jìn)行分組，分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。（1）空白對(duì)照組：加入生理鹽水5μL；（2）YC-1 組：加入濃度為 0.1μmol/μL 的 YC-1 5μL（終濃度 10ng/mL）；（3）輻射（RT）組：60Co-γ 射線 2Gy，單次照射；（4）YC-1+RT組：加入5μL YC-1作用24h后給予60Co-γ射線2Gy單次照射。

1.2.2 AnnexinV/PI染色觀察細(xì)胞凋亡 將處理后24h的MIA-PaCa2細(xì)胞調(diào)整至濃度為106個(gè)/mL，從中收集200μL。離心重懸后，加入Annexin-V-FITC。在每組細(xì)胞中加入PI后2min迅速檢測(cè)。同時(shí)以不加Annexin V-FITC及PI的一管作為陰性對(duì)照。

1.2.3 Western Blot法檢測(cè)MIA-PaCa2細(xì)胞HIF-1ɑ、VEGF的表達(dá)量 干預(yù)處理24h后收集各組細(xì)胞，使用蛋白裂解液（含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑）提取總蛋白，采用BCA法檢測(cè)蛋白濃度。取30～50μg的蛋白樣品，隨后進(jìn)行SDSPAGE電泳分離，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，進(jìn)行封閉；加入一抗H1alpha67（1：1000），VG1（1：1000），4 ℃ 過(guò) 夜；加入二抗后室溫孵育1～2h，TBST洗滌。使用ECL底物化學(xué)進(jìn)行發(fā)光顯色，通過(guò)Bio-rad化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光分析。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS22.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以（±s）表示，采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同處理方法對(duì)MIA-PaCa2細(xì)胞凋亡的影響

經(jīng)檢測(cè)，RT組、YC-1組及聯(lián)合治療組的細(xì)胞凋亡率均高于空白對(duì)照組；而通過(guò)RT組誘導(dǎo)凋亡的效果強(qiáng)于YC-1組，但結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），聯(lián)合治療組的凋亡率明顯高于其它處理組（P＜0.05）（見(jiàn)圖1）。

圖1 不同處理方法對(duì)MIA-PaCa2細(xì)胞凋亡的影響

2.2 不同方法處理后對(duì)MIA PaCa-2細(xì)胞HIF-1ɑ及VEGF蛋白表達(dá)量的影響

經(jīng)過(guò)24h后，YC-1組HIF-1ɑ的表達(dá)降低，RT組HIF-1ɑ的表達(dá)高于YC-1組，且稍高于空白對(duì)照組。相較于空白組，YC-1組及單純RT組，YC-1+RT聯(lián)合治療組中HIF-1ɑ的表達(dá)降低。

單獨(dú)放療組中VEGF蛋白的表達(dá)高于空白對(duì)照組及YC-1組，同時(shí)YC-1組中，VEGF表達(dá)較空白對(duì)照組低。在YC-1及RT聯(lián)合治療組中，VEGF的表達(dá)低于RT組，并稍高于YC-1組及空白對(duì)照組（見(jiàn)圖 2）。

圖2 不同干預(yù)方式對(duì)MIA PaCa-2細(xì)胞HIF-1ɑ及VEGF蛋白表達(dá)量的影響

3 討論

HIF-1ɑ是HIF-1的活性亞基和調(diào)節(jié)亞基，在機(jī)體低氧適應(yīng)和病理反應(yīng)中起重要作用，是關(guān)鍵的氧調(diào)節(jié)亞基。研究發(fā)現(xiàn)在胰腺癌細(xì)胞中，HIF-1ɑ的含量與細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為存在正相關(guān)[6-7]。Shibaji T等[7]針對(duì)胰腺癌的研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1ɑ與腫瘤轉(zhuǎn)移、VEGF 表達(dá)及間質(zhì)微血管密度（IMD）相關(guān)，可以用來(lái)評(píng)估預(yù)后。在已知的血管生成蛋白中，VEGF是作用最直接的可溶性促內(nèi)皮細(xì)胞分裂素，同時(shí)也支持著血管內(nèi)皮細(xì)胞的存活。國(guó)內(nèi)外研究發(fā)，VEGF通過(guò)多種作用機(jī)制促進(jìn)腫瘤血管生成并增強(qiáng)血液流通以持續(xù)供給腫瘤組織養(yǎng)分與氧氣[8]。在腫瘤乏氧的微環(huán)境中，HIF-1ɑ可上調(diào)VEFG表達(dá)，促進(jìn)腫瘤血管生成。目前，拮抗VEGF的表達(dá)，降低其對(duì)微血管輻射損傷的保護(hù)，成為逆轉(zhuǎn)輻射抵抗的重要策略。

本研究中，選擇低表達(dá)HIF-1ɑ的胰腺癌細(xì)胞菌株MIA-PaCa2，通過(guò)輻射可上調(diào)HIF-1ɑ的表達(dá)。腫瘤微環(huán)境在電離輻射作用下產(chǎn)生乏氧條件，而在乏氧環(huán)境下HIF-1ɑ可穩(wěn)定表達(dá)[9]。在腫瘤乏氧調(diào)節(jié)中，HIF-1ɑ具有中樞紐帶地位，其高表達(dá)與輻射抵抗相關(guān)[10]。通過(guò)檢測(cè)MIA-PaCa2細(xì)胞的凋亡情況可知，使用HIF-1ɑ抑制劑后，電離輻射引起的細(xì)胞凋亡及死亡率相較于未使用抑制劑組高。電離輻射通過(guò)直接或間接的方式損傷腫瘤細(xì)胞DNA，從而殺滅腫瘤細(xì)胞，然而，輻射可促進(jìn)HIF-1ɑ的表達(dá)，提高腫瘤細(xì)胞的輻射抗性[11-12]。通過(guò)利用YC-1下調(diào)HIF-1ɑ的表達(dá)，能夠降低腫瘤細(xì)胞的輻射抵抗，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡及死亡。Akakura N等[6]研究者對(duì)20種人胰腺癌細(xì)胞株進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其中75%人胰腺癌細(xì)胞株穩(wěn)定表達(dá)HIF-1ɑ，且HIF-1ɑ在胰腺癌細(xì)胞抵抗乏氧和低糖誘導(dǎo)的凋亡中發(fā)揮重要作用。通過(guò)轉(zhuǎn)染 HIF-1ɑ也可以提高對(duì)凋亡的抵抗及增加體內(nèi)的腫瘤生成，這與我們的研究結(jié)果相符。

在腫瘤乏氧的微環(huán)境中，HIF-1ɑ可上調(diào)VEGF表達(dá)，VEGF通過(guò)參與內(nèi)皮細(xì)胞增殖、分裂和遷移過(guò)程并促進(jìn)腫瘤血管生成[13-15]。Itakura J等[16]在人胰腺癌組織及胰腺癌細(xì)胞株中檢測(cè)VEGF的表達(dá)，證實(shí)胰腺癌細(xì)胞具有過(guò)表達(dá) VEGF及其受體的能力，并發(fā)現(xiàn)其可以通過(guò)絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）途徑促進(jìn)胰腺癌生長(zhǎng)主。本研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)抑制HIF-1ɑ的表達(dá)，能夠使得VEGF的表達(dá)降低。經(jīng)過(guò)輻射處理后的胰腺癌細(xì)胞VEGF表達(dá)上調(diào)。輻射也可通過(guò)上調(diào)HIF-1ɑ的表達(dá)，進(jìn)而影響下游蛋白VEGF。在腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中，VEGF都起著至關(guān)重要的作用，VEGF將是一個(gè)潛在的腫瘤治療靶點(diǎn)[15]。通過(guò)抑制HIF-1ɑ表達(dá)，可間接影響VEGF蛋白。在使用HIF-1ɑ抑制劑后進(jìn)行輻射處理，MIA-PaCa2細(xì)胞VEGF的表達(dá)較直接輻射低。由此可見(jiàn)，使用HIF-1ɑ抑制劑可以逆轉(zhuǎn)輻射上調(diào)VEGF引起的輻射抵抗。

Zhao Q 等[5]研究者針對(duì)乏氧環(huán)境下下人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其高表達(dá)HIF-1ɑ；通過(guò)利用HIF-1ɑ抑制劑YC-1，可明顯下調(diào)其表達(dá)，并進(jìn)一步降低了VEGF表達(dá)，從而誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞的凋亡并抑制其進(jìn)一步增殖。前期體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，降低食管癌細(xì)胞中HIF-1ɑ及VEGF的表達(dá)可以提高輻射敏感性[17-18]。同時(shí)在一些惡性腫瘤患者中，HIF-1ɑ及VEGF與腫瘤患者的預(yù)后相關(guān)[19]，HIF-1ɑ還是抗表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）治療的預(yù)后指標(biāo)[20]。不管是在體內(nèi)還是體外，亦或是在人體組織中，關(guān)于胰腺癌HIF-1ɑ及VEGF與電離輻射相結(jié)合的研究相對(duì)較少。本研究在常氧條件下利用低表達(dá)HIF-1ɑ的胰腺癌細(xì)胞菌株MIA-PaCa2及電離輻射，驗(yàn)證了電離輻射可以上調(diào)HIF-1ɑ及VEGF的表達(dá)。同時(shí)，抑制HIF-1ɑ可以提高輻射敏感性。

綜上所述，本研究通過(guò)觀察輻射與HIF-1ɑ抑制劑YC-1聯(lián)合應(yīng)用對(duì)胰腺癌MIA-PaCa2細(xì)胞凋亡的影響及HIF-1ɑ、VEGF蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示電離輻射可促進(jìn)HIF-1ɑ及VEGF蛋白表達(dá)；予YC-1處理后進(jìn)行輻射處理，可逆轉(zhuǎn)輻射對(duì)HIF-1ɑ及VEGF的上調(diào)作用。YC-1聯(lián)合電離輻射能協(xié)同促進(jìn)胰腺癌MIA-Paca2細(xì)胞凋亡， 其機(jī)制可能是通過(guò)抑制HIF-1ɑ，使VEGF表達(dá)下調(diào)，降低其對(duì)輻射損傷的保護(hù)作用，同時(shí)能夠誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞的凋亡，提高放射敏感性。