梁泳娜 梁見(jiàn)弟 陳燕鋒 劉志剛

廣東省東莞市人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，廣東東莞 523018

世界衛(wèi)生組織調(diào)查顯示，全世界發(fā)達(dá)國(guó)家約8%～15%的夫婦受不孕癥困擾，一些發(fā)展中國(guó)家的不孕癥發(fā)生率甚至可達(dá)35%以上，且不孕癥發(fā)生率呈逐年上升趨勢(shì)[1]。體外授精-胚胎移植（IVFET）是常用的輔助生殖技術(shù)，通過(guò)促排卵和體外受精可獲得多個(gè)胚胎，優(yōu)質(zhì)胚胎的選擇不僅對(duì)妊娠率的提高有著很大幫助，也能改善妊娠結(jié)局。時(shí)差成像系統(tǒng)（time-lapse imaging，TLI）作為非侵入胚胎評(píng)估系統(tǒng)，評(píng)估過(guò)程不影響胚胎的發(fā)育，并能獲得連續(xù)的胚胎動(dòng)力學(xué)參數(shù)，從而準(zhǔn)確評(píng)估其發(fā)育潛能[2]。目前國(guó)內(nèi)在胚胎形態(tài)動(dòng)力學(xué)尚未建立一個(gè)較為科學(xué)的評(píng)估體系用于挑選最具妊娠潛力的胚胎，本研究將TLI技術(shù)應(yīng)用于IVF-ET中，觀察其臨床應(yīng)用價(jià)值。對(duì)于TLI采用的WOW（well-of-the-well）集簇培養(yǎng)方式是否對(duì)胚胎發(fā)育潛能有影響，結(jié)局是否優(yōu)于傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，國(guó)內(nèi)鮮少有報(bào)道。本研究比較兩種培養(yǎng)方法的胚胎發(fā)育情況，為TLI技術(shù)的安全性尋求依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

分析在東莞市人民醫(yī)院生殖中心2015年8月～2017年5月接受IVF-ET治療的不孕癥患者98例。隨機(jī)分組，實(shí)驗(yàn)組（A組）為47例常規(guī)IVF治療患者，所有胚胎經(jīng)TLI選擇并移植。同期51例常規(guī)IVF治療患者采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，并在Day3經(jīng)形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)挑選胚胎進(jìn)行移植為對(duì)照組（B組）。兩組患者資料與受精情況類似，具有可比性（表1）。同期另選取共478枚胚胎，同一患者胚胎隨機(jī)分為兩組，一組采用TLI集簇培養(yǎng)（C組），另一組采用微滴單胚胎常規(guī)方法培養(yǎng)（D組）。納入標(biāo)準(zhǔn)：女方年齡＜40歲；常規(guī)IVF周期；周期數(shù)＜2；獲取卵子數(shù)6～16枚；常規(guī)長(zhǎng)方案促排卵；卵泡刺激素（FSH）≤12IU/L。排除子宮內(nèi)膜疾病或其他生殖器官疾病者；男性因素所致不孕者；先天性疾病者和全胚冷凍者。

1.2 方法

1.2.1 時(shí)差成像系統(tǒng) 本研究使用Primo Vision（Vitrolife）時(shí)差成像系統(tǒng)，圖像采集頻率為7min/次，每小時(shí)進(jìn)行一次7個(gè)等焦距平面掃描，連續(xù)培養(yǎng)6d。培養(yǎng)采用9孔WOW培養(yǎng)皿，各孔均有位置標(biāo)記。

1.2.2 胚胎培養(yǎng) 全部患者采用本中心常規(guī)促排方案，注射人絨毛膜促性腺激素（hCG）后36h行卵泡穿刺術(shù)，將獲得卵冠丘復(fù)合物（OCCC）放于G-IVF plus（Vitrolife）等待受精，受精時(shí)間為注射hCG 39h。受精6h后去除顆粒細(xì)胞，A組和C組胚胎移入WOW9孔培養(yǎng)皿，培養(yǎng)液滴為70μL經(jīng)（37℃ 6% CO2，5% O2）平衡過(guò)夜的 G-1 plus。根據(jù)胚胎發(fā)育的動(dòng)力學(xué)參數(shù)與卵裂模式選擇D3胚胎移植，剩余胚胎繼續(xù)置于平衡過(guò)夜的G-2 plus培養(yǎng)至D6結(jié)束。B組和D組胚胎移入含25μL G-1 plus微滴中進(jìn)行單胚胎常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.3 胚胎發(fā)育時(shí)間參數(shù)與妊娠判定 時(shí)間參數(shù)：將IVF受精時(shí)間記為”0”點(diǎn)，原核消失時(shí)間（tPNF），發(fā)育至2細(xì)胞時(shí)間為t2，發(fā)育至3細(xì)胞時(shí)間為t3，以此類推為t4、t5。2細(xì)胞發(fā)育至3細(xì)胞持續(xù)時(shí)間為cc2，3細(xì)胞發(fā)育至4細(xì)胞同步時(shí)間為s2。各時(shí)間點(diǎn)的命名方法參照Ciray[3]標(biāo)準(zhǔn)。依據(jù)伊斯坦布爾共識(shí)，卵裂期胚胎評(píng)估參考Peter[4]標(biāo)準(zhǔn)，囊胚期胚胎評(píng)估參考Gardner[5]標(biāo)準(zhǔn)。優(yōu)質(zhì)胚胎：細(xì)胞數(shù)7 ～ 9個(gè)，碎片＜10%，大小均一；Day3可利用胚胎：細(xì)胞數(shù)≥6個(gè)，碎片＜25%，大小均一。優(yōu)質(zhì)囊胚：內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層細(xì)胞不含C。妊娠判定：D3移植2枚胚胎，2周后檢測(cè)血hCG，6周進(jìn)行B超檢查，可見(jiàn)孕囊或胎心搏動(dòng)即為臨床妊娠。

1.3 觀察指標(biāo)

分析比較實(shí)驗(yàn)組（A組）與對(duì)照組（B組）的D3優(yōu)質(zhì)胚胎率、臨床妊娠率、胚胎種植率、早期流產(chǎn)率的差異。采用Analyzer圖像分析軟件比較實(shí)驗(yàn)組（A組）種植胚胎與未種植胚胎的tPNF，t2，t3，t4，t5，cc2，s2。比較C組與D組的來(lái)源于2PN的胚胎的卵裂率、D3優(yōu)質(zhì)胚胎率、D3可利用胚胎率、囊胚形成率、優(yōu)質(zhì)囊胚率的差異。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS20.0軟件處理本研究所有數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 兩組患者一般資料比較（± s）

表1 兩組患者一般資料比較（± s）

注：P均＞0.05

組別 女方年齡（歲） BMI（kg/m2） 基礎(chǔ)FSH（IU/L） 平均獲卵數(shù) 平均移植胚胎數(shù)A組 31.2±4.3 22.42±2.38 7.2±1.8 11.7±6.7 1.95±0.46 B組 31.1±4.8 22.68±3.02 7.3±1.9 12.3±7.6 1.92±0.45

表2 兩組患者妊娠結(jié)局比較[%（n/n）]

表3 時(shí)間參數(shù)與胚胎發(fā)育潛能的關(guān)系分析（± s）

表3 時(shí)間參數(shù)與胚胎發(fā)育潛能的關(guān)系分析（± s）

組別 n tPNF t2 t3 t4 t5 cc2 s2種植胚胎 33 23.25±2.9 24.02±0.21 33.68±2.58 35.24±2.69 47.32±5.47 9.58±2.01 0.81±0.14未種植胚胎 45 25.38±2.27 26.41±2.08 34.21±2.41 36.84±4.14 48.89±5.36 12.36±3.17 3.52±4.08 t 3.652 6.564 0.931 1.938 0.347 4.423 3.807 P 0.013 0.006 0.354 0.056 0.729 0.021 0.009

表4 胚胎TLI集簇培養(yǎng)與常規(guī)培養(yǎng)結(jié)果比較[%（n/n）]

2 結(jié)果

2.1 兩組患者妊娠結(jié)局比較

A組與B組的臨床妊娠率、胚胎種植率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、早期流產(chǎn)率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表2。

2.2 時(shí)間參數(shù)與胚胎發(fā)育潛能的關(guān)系

A組種植胚胎與未種植胚胎相比，tPNF、t2、cc2、s2=t4-t3，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05），t3、t4、t5差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表3。

2.3 不同培養(yǎng)方式對(duì)胚胎發(fā)育潛能的影響

C組與D組的來(lái)源于2PN胚胎的卵裂率、D3優(yōu)質(zhì)胚胎率、D3可利用胚胎率、囊胚形成率、優(yōu)質(zhì)囊胚率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表4。

3 討論

有研究[6]顯示，胚胎在某一時(shí)間點(diǎn)的形態(tài)及發(fā)育狀態(tài)與其發(fā)育潛能密切相關(guān)。臨床大多采用形態(tài)評(píng)分系統(tǒng)對(duì)胚胎潛能進(jìn)行評(píng)估，但是胚胎在移植前的發(fā)育是動(dòng)態(tài)的，伴隨胚胎的卵裂，其形態(tài)會(huì)不斷變化。若未進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察，則難以獲取精確的卵裂參數(shù)。通過(guò)胚胎多次移出培養(yǎng)箱雖然能獲取更多發(fā)育信息，但頻繁改變胚胎培養(yǎng)環(huán)境，不利于胚胎發(fā)育。TLI作為非侵入胚胎評(píng)估系統(tǒng)，克服了傳統(tǒng)胚胎評(píng)分中存在的缺陷，可通過(guò)觀察胚胎受精至移植時(shí)的連續(xù)動(dòng)態(tài)分裂圖像，以及更多的胚胎質(zhì)量篩選指標(biāo)，從而提高臨床妊娠率[7]。

現(xiàn)已證明，TLI主要以前3次卵裂時(shí)間及卵裂同步性來(lái)判斷胚胎的質(zhì)量[8]。本研究顯示，種植胚胎與未種植胚胎的tPNF、t2、cc2、s2差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相符[9]。說(shuō)明時(shí)間動(dòng)力學(xué)參數(shù)可作為胚胎篩選的主要指標(biāo)。也有學(xué)者認(rèn)為[10]，單憑時(shí)間參數(shù)進(jìn)行胚胎挑選會(huì)降低準(zhǔn)確性。同時(shí)應(yīng)結(jié)合胚胎發(fā)育前期的卵裂模式和不良事件（碎片、不均卵裂、多核、混合型、非二倍性卵裂、發(fā)育停滯、卵裂球融合等）去挑選胚胎，可有效排除靜態(tài)評(píng)估中判斷為正常卵裂的異常卵裂胚胎[11]。2個(gè)胚胎在形態(tài)學(xué)相似情況下，通過(guò)TLI可觀察到不同的發(fā)育過(guò)程，為臨床選擇優(yōu)質(zhì)胚胎提供參考依據(jù)，有助于改善臨床妊娠率[12]。在本研究中，A組臨床妊娠率、胚胎種植率、優(yōu)質(zhì)胚胎率較B組有一定的提高，可能與應(yīng)用TLI排除了一些前期不良胚胎發(fā)育事件有關(guān)，但是兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明常規(guī)胚胎評(píng)分同樣具有一定的科學(xué)性和有效性，也可能與本研究例數(shù)較少有關(guān)，需要更多研究進(jìn)一步探討TLI對(duì)IVF-ET妊娠結(jié)局的影響。有研究表明[13]，通過(guò)卵裂模式對(duì)胚胎進(jìn)行篩選，可以降低早期流產(chǎn)率，也與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符：實(shí)驗(yàn)組的早期流產(chǎn)率明顯降低（3.33%vs15.38%）。

盡管TLI與傳統(tǒng)培養(yǎng)相比有著很多優(yōu)勢(shì)，然而TLI的安全性也受到廣泛關(guān)注。作為一種新的醫(yī)療技術(shù)，此系統(tǒng)與傳統(tǒng)觀察方法不同的是攝像觀察的次數(shù)與光源。長(zhǎng)期高頻率每隔7分鐘一次的拍攝曝光，550nm波長(zhǎng)的短波可見(jiàn)光（200～700nm）可能對(duì)胚胎發(fā)育有害。也有學(xué)者認(rèn)為[14]，總光源暴露的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于倒置顯微鏡的光線輻射：primo vision曝光時(shí)間為100ms，以每隔7min拍攝一次計(jì)算，每枚胚胎在連續(xù)3d的培養(yǎng)中可獲得617張圖像，總的曝光時(shí)間為61.7s，僅相當(dāng)于傳統(tǒng)曝光時(shí)間的1/3。傳統(tǒng)的觀察方法在3d的觀察中，胚胎暴露在倒置顯微鏡光源的時(shí)間總計(jì)平均為2～3min。時(shí)差系統(tǒng)光源為低強(qiáng)度LED，光強(qiáng)度是傳統(tǒng)顯微鏡光源的1/20，550nm波長(zhǎng)避開了抑制胚胎發(fā)育光譜范圍，而傳統(tǒng)倒置顯微鏡光源有15%的光譜在550nm以下。在本實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組（A組）與對(duì)照組（B組）的優(yōu)質(zhì)胚胎率、臨床妊娠率、胚胎種植率、早期流產(chǎn)率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；另外，為了減少不同周期中患者個(gè)體差異，設(shè)計(jì)同一周期隨機(jī)分成兩組（C組和D組），比較TLI的安全性。只選來(lái)源于2PN胚胎，其卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、Day3可利用胚胎率、 囊胚形成率、優(yōu)質(zhì)囊胚率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但C組數(shù)據(jù)均略高于D組，可能與TLI集簇培養(yǎng)有關(guān)。時(shí)差成像系統(tǒng)采用WOW集簇培養(yǎng)法，既實(shí)現(xiàn)了對(duì)每個(gè)胚胎的追蹤，獨(dú)立監(jiān)測(cè)，又可以讓9個(gè)胚胎共享更大體積的培養(yǎng)液。有研究[15]證實(shí)，體外培養(yǎng)的胚胎具旁分泌和自分泌效應(yīng)，這些生長(zhǎng)因子相互作用帶來(lái)更好的互利培養(yǎng)環(huán)境。因而集簇培養(yǎng)能令每個(gè)胚胎獲得更佳的發(fā)育質(zhì)量，更利于囊胚形成。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與相關(guān)研究報(bào)道結(jié)果相符[16]，提示TLI系統(tǒng)是安全可靠的，可以放心使用。

綜上所述，TLI時(shí)差成像系統(tǒng)能夠動(dòng)態(tài)觀察胚胎發(fā)育情況，通過(guò)時(shí)間參數(shù)與卵裂模式可判斷胚胎發(fā)育潛能，為臨床挑選優(yōu)質(zhì)胚胎提供參考，有利于改善臨床妊娠結(jié)局。