董 年， 陳俊杰▲， 石 林， 陳成水△

(1溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科， 浙江 溫州 325000; 2復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院呼吸內(nèi)科， 上海 200000)

遷移和侵襲是腫瘤的惡性生物學(xué)行為之一[1]，也是肺癌病死率居高不下且遠(yuǎn)期預(yù)后不良的主要原因之一。肺癌遷移和侵襲的分子調(diào)控機(jī)制復(fù)雜，近年來逐漸認(rèn)識到雌激素受體(estrogen receptor，ER)是潛在的調(diào)控靶點(diǎn)之一[2]。ER根據(jù)分子結(jié)構(gòu)分為ERα和ERβ，根據(jù)功能途徑可以劃分為胞膜受體(membrane estrogen receptor，mER)和胞核受體(nuclear estrogen receptor，nER)， 其中mER介導(dǎo)新發(fā)現(xiàn)的胞膜啟動(dòng)的類固醇信號(membrane-initiated steroid signaling，MISS)傳導(dǎo)途徑，nER介導(dǎo)經(jīng)典的胞核啟動(dòng)的類固醇信號(nuclear-initiated steroid signaling，NISS)傳導(dǎo)途徑[3]。目前針對肺癌細(xì)胞中ER亞型表達(dá)尚存爭議，綜合而言ERβ相較于ERα在肺癌中表達(dá)更為普遍[4]。一項(xiàng)針對肺癌組織免疫組化研究報(bào)道，胞質(zhì)ERβ的表達(dá)與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后密切相關(guān)[5]，同時(shí)有研究報(bào)道肺癌細(xì)胞中ERβ主要經(jīng)MISS途徑發(fā)揮作用[6]，但目前肺癌中ERβ是否經(jīng)MISS途徑調(diào)控肺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移尚未闡明。結(jié)合前期ERK1/2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在調(diào)控肺癌侵襲和轉(zhuǎn)移方面的研究[7]，本研究擬在闡明肺癌A549細(xì)胞中ER表達(dá)和胞內(nèi)定位的基礎(chǔ)上，探討β-雌二醇(β-estradiol，E2)是否經(jīng)ER調(diào)控雌激素胞膜信號傳導(dǎo)途徑，進(jìn)而調(diào)控肺癌細(xì)胞遷移和侵襲，以深入揭示肺癌遷移和侵襲的分子機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

乳腺癌MCF-7細(xì)胞和肺癌A549細(xì)胞購于上海中科院細(xì)胞庫。

2 主要試劑

EMEM培養(yǎng)液、RPMI-1640培養(yǎng)液和胎牛血清購自Gibco；活性炭吸附胎牛血清和TRIzol購自Invitrogen；ERK1/2抑制劑PD98059和β-雌二醇購自Sigma；BCA 蛋白濃度測定試劑盒、預(yù)染蛋白Marker和ECL 發(fā)光液購自Thermo；兔抗人ERα、p-ERK1/2和ERK1/2抗體購自CST；兔抗人ERβ和GAPDH抗體購自Santa Cruz； cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa；其它生化試劑購自上海生工生物工程公司。Real-time PCR引物由上海生工生物工程公司設(shè)計(jì)合成，序列見表1。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1細(xì)胞培養(yǎng) MCF-7細(xì)胞使用包含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素和10 mg/L胰島素的EMEM培養(yǎng)液， A549細(xì)胞使用包含10%胎牛和1%青霉素/鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。使用0.25%胰酶溶液進(jìn)行消化傳代，獲取生長狀況良好的對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。進(jìn)行雌激素信號通路和遷移功能相關(guān)實(shí)驗(yàn)時(shí)，將10%胎牛血清培養(yǎng)液改換5%活性炭吸附胎牛血清無酚紅培養(yǎng)液。

表1 Real-time PCR引物序列Table 1.The sequences of the primers for real-time PCR

3.2Real-time PCR實(shí)驗(yàn) 獲取生長狀況良好的對數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞和A549細(xì)胞，按照TRIzol說明書提取細(xì)胞總RNA，分光光度法測定計(jì)算提取的總RNA含量及濃度。取總RNA 2 μg反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以適量cDNA為模板進(jìn)行real-time PCR實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)條件為: 95 ℃ 30 s； 95 ℃ 5 s、 60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。結(jié)果以GAPDH為內(nèi)參照，所得數(shù)據(jù)以2-ΔΔCt法計(jì)算。

3.3Western blot實(shí)驗(yàn) 獲取生長狀況良好的對數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞和A549細(xì)胞，細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，4 ℃、20 913×g離心10 min提取上清液，使用BCA測定蛋白濃度。2種細(xì)胞分別取30 μg蛋白行SDS-PAGE，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫下封閉2 h， I抗(1 ∶1 000)4 ℃孵育過夜，TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min, II抗(1∶5 000)室溫孵育1.5 h，再用TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min,ECL化學(xué)發(fā)光法顯影。以GAPDH為內(nèi)參照，結(jié)果以不同處理組蛋白與GAPDH灰度值比值表示。

獲取生長狀況良好的對數(shù)生長期的A549細(xì)胞，更換5%活性炭吸附胎牛血清無酚紅RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后，按照實(shí)驗(yàn)分組使用10 nmol/L β-estradiol分別刺激A549細(xì)胞10、20和30 min，Western blot實(shí)驗(yàn)方法如上所述，檢測ERK1/2信號通路磷酸化情況。

3.4免疫熒光染色 獲取生長狀況良好的對數(shù)生長期的A549細(xì)胞，玻璃爬片事先置于24孔板，24孔板每孔接種5×104個(gè)細(xì)胞，待次日細(xì)胞貼壁后4%多聚甲醛固定15 min，0.1%GEPAL穿孔破膜10 min，1%BSA封閉1 h，I抗(1∶200)4 ℃孵育過夜，II抗(1∶200)室溫孵育0.5 h，DAPI染核5 min，封片激光共聚焦顯微鏡觀察。

3.5Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn) 獲取生長狀況良好的對數(shù)生長期的A549細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液并調(diào)整細(xì)胞密度1×108/L，取200 μL細(xì)胞懸液接種Transwell上室(包被Matrigel)，24孔板下室添加600 μL 5%活性炭吸附胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液，5%活性炭吸附胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液中按照實(shí)驗(yàn)分組分別添加1、10 和100 nmol/L 3個(gè)濃度的β-estradiol，培養(yǎng)細(xì)胞24 h。取出Tranwell上室，棄去孔中培養(yǎng)液，PBS清洗1遍后使用4%多聚甲醛固定20 min，將小室適當(dāng)風(fēng)干，吉姆薩染色10 min，使用棉簽擦拭小室上層未遷移的細(xì)胞，雙蒸水洗凈，400倍顯微鏡下隨機(jī)5個(gè)視野觀察細(xì)胞數(shù)量。

獲取生長狀況良好的對數(shù)生長期的A549細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液并調(diào)整細(xì)胞密度1×108/L，取200 μL細(xì)胞懸液接種Transwell上室，24孔板下室添加600 μL 5%活性炭吸附胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液，5%活性炭吸附胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液中按照實(shí)驗(yàn)分組分別添加10、20、40 μmol/L 3個(gè)濃度的PD98059, 2 h后再添加10 nmol/L β-estradiol刺激24 h，Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)方法如上所述，檢測A549細(xì)胞的侵襲能力。

3.6細(xì)胞實(shí)時(shí)監(jiān)測培養(yǎng)系統(tǒng)(Cell-IQ)監(jiān)測細(xì)胞遷移能力 獲取生長狀況良好的對數(shù)生長期的A549細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液調(diào)整細(xì)胞密度2×107/L，于24孔板每孔添加細(xì)胞懸液0.5 mL，培養(yǎng)24 h等待細(xì)胞貼壁后更換5%活性炭吸附胎牛血清無酚紅RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，具體實(shí)驗(yàn)分組同Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)分組，24孔板置入細(xì)胞實(shí)時(shí)檢測培養(yǎng)系統(tǒng)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)分組設(shè)置6～12個(gè)檢測位點(diǎn)，每6 min系統(tǒng)拍攝照片一次。待置入細(xì)胞實(shí)時(shí)檢測培養(yǎng)系統(tǒng)72 h后，分析軟件計(jì)算統(tǒng)計(jì)細(xì)胞的遷移能力。細(xì)胞移動(dòng)度的統(tǒng)計(jì)方法：在某一時(shí)點(diǎn)，所有的細(xì)胞相對于6 min前的記錄圖像中的移動(dòng)距離總和。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 肺癌A549細(xì)胞中ER表達(dá)以ERβ為主

選取乳腺癌細(xì)胞MCF-7作為陽性對照，real-time PCR和Western-blot檢測肺癌細(xì)胞A549中ERα和ERβ的表達(dá)，結(jié)果顯示A549細(xì)胞以表達(dá)ERβ為主，見圖1。

Figure 1.The dominant ERβ in lung cancer A549 cells. A: the mRNA expression of ERα and ERβ in breast cancer cells and lung cancer cells; B: the protein levels of ERα and ERβ in breast cancer cells and lung cancer cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsMCF-7.

圖1肺癌A549細(xì)胞中ER表達(dá)以ERβ為主

2 肺癌A549細(xì)胞中以表達(dá)ERβ胞質(zhì)亞型為主

Real-time PCR檢測A549細(xì)胞中ERβ亞型的表達(dá)，結(jié)果顯示以ERβ2 和ERβ5胞質(zhì)亞型為主，見圖2A。免疫熒光定位結(jié)果顯示，ERβ在A549細(xì)胞胞質(zhì)和胞核中皆有分布，但以胞質(zhì)分布為主，圖2B。

Figure 2.The dominant cytoplasmic ERβ in lung cancer A549 cells. A: the mRNA expression of ERβ1, ERβ2 and ERβ5 in lung cancer cells; B: the immunofluorescence of ERβ location in lung cancer cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsERβ1.

圖2肺癌A549細(xì)胞中以表達(dá)ERβ胞質(zhì)亞型為主

3 β-Estradiol引起ERK1/2磷酸化水平增加并促進(jìn)A549細(xì)胞的遷移和侵襲

使用β-estradiol刺激A549細(xì)胞不同時(shí)間， Western blot法結(jié)果顯示,與空白組相比,β-estradiol可以增加ERK1/2蛋白的磷酸化水平，以30 min時(shí)點(diǎn)最為明顯(P<0.05)，見圖3A。Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)和活細(xì)胞檢測培養(yǎng)系統(tǒng)結(jié)果顯示,與空白組相比，β-estradiol在可以促進(jìn)A549細(xì)胞的遷移和侵襲能力，以100 nmol/L濃度最為明顯，呈現(xiàn)濃度依賴性增加(P<0.05)，見圖3B、C。

Figure 3.β-Estradiol (E2) induced phosphorylation of ERK1/2 and promoted the invasion and migration of lung cancer A549 cells. A: the protein levels of p-ERK1/2 and ERK1/2 in A549 cells treated with E2(10 nmol/L) for the indicated time were detected by Western blot; B: the invasion capacity of A549 cells treated with E2at the indicated doses was detected by Transwell assay; C: the migration capacity of A549 cells treated with E2at the indicated doses was detected by Cell-IQ assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖3β-estradiol引起ERK1/2磷酸化水平增加并促進(jìn)A549肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力

4 抑制ERK1/2信號傳導(dǎo)可以逆轉(zhuǎn)β-estradiol促進(jìn)的肺癌A549細(xì)胞侵襲和遷移

使用ERK1/2抑制劑PD98059與β-estradiol共同處理A549細(xì)胞，Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)和活細(xì)胞檢測培養(yǎng)系統(tǒng)結(jié)果顯示, ERK1/2抑制劑PD98059可以逆轉(zhuǎn)β-estradiol促進(jìn)的細(xì)胞侵襲和遷移能力提高，以40 μmol/L PD98059最為明顯(P<0.05)，見圖4。

討 論

腫瘤遷移和侵襲主要包括可逆的細(xì)胞骨架重整和持久的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，涉及快速活化的胞膜信號傳導(dǎo)和持久調(diào)控的胞核信號傳導(dǎo)途徑的雙重調(diào)控[8-9]，尋找膜核信號傳導(dǎo)中的關(guān)鍵信號節(jié)點(diǎn)可以深入揭示肺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。Marquez-Garban等[10]研究報(bào)道ER與肺癌臨床預(yù)后密切相關(guān)，其中腫瘤組織免疫組化mER陽性表達(dá)預(yù)示著更高的臨床分期，提示mER可能參與腫瘤的遷徙侵襲過程。與nER介導(dǎo)的NISS傳導(dǎo)途徑調(diào)控存在經(jīng)典的雌激素反應(yīng)元件(estrogen response element，ERE)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯不同，mER介導(dǎo)的MISS傳導(dǎo)途徑調(diào)控c-Src和Ras等蛋白激酶的活化[11]。目前mER介導(dǎo)的MISS在腫瘤、增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用是目前研究熱點(diǎn)[12]。與乳腺癌中ERα主導(dǎo)角色不同的是，目前肺癌中ER亞型的表達(dá)尚存爭議，一方面是沒有使用統(tǒng)一的ER抗體和免疫組化讀片陽性標(biāo)準(zhǔn)，另一方面是ER亞型存在不同的剪切異構(gòu)體，ERα包括ERα66、ERα46和ERα36[13]，ERβ存在ERβ1、ERβ2、ERβ4和ERβ5[14]。因此，本研究首先選擇了乳腺癌MCF-7細(xì)胞作為陽性對照，以肺癌A549細(xì)胞作為研究對象，檢測出A549細(xì)胞以表達(dá)ERβ為主。Wang等[15]報(bào)道，肺癌中ERβ以表達(dá)ERβ1(胞膜分布和胞核分布)、ERβ2(以胞膜分布為主)和ERβ5(以胞膜分布為主)為主。由于目前缺乏特異性ERβ1、ERβ2和ERβ5抗體，本研究設(shè)計(jì)合成不同ERβ剪切異構(gòu)體引物，采用real-time PCR檢測顯示A549細(xì)胞以ERβ2和ERβ5表達(dá)為主，熒光定位進(jìn)一步揭示肺癌細(xì)胞中ERβ以胞膜分布為主，意味著MISS途徑是A549細(xì)胞中ERβ發(fā)揮功能的主要途徑。以上研究在細(xì)胞水平深入闡明了ERβ是A549細(xì)胞中主要ER，并且mERβ主要經(jīng)MISS途徑發(fā)揮作用而調(diào)控細(xì)胞生物學(xué)行為。

Figure 4.Inhibition of ERK1/2 reversed β-estradiol (E2)-promoted invasion (A) and migration (B) of lung cancer A549 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsE2group.

圖4抑制ERK1/2信號傳導(dǎo)可以逆轉(zhuǎn)β-estradiol促進(jìn)的肺癌A549細(xì)胞侵襲和遷移

既往對ER在肺癌遷移和侵襲方面的研究主要圍繞ER的NISS途徑，包括上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和骨橋蛋白的分泌等[16-17]，以上NISS途徑涉及胞內(nèi)蛋白的轉(zhuǎn)錄和翻譯，需要較長時(shí)間。本研究選擇β-estradiol刺激A549細(xì)胞24 h后，通常尚未發(fā)生NISS途徑介導(dǎo)蛋白水平明顯變化，檢測到細(xì)胞遷移和侵襲能力的提高，因此推測mERβ經(jīng)MISS傳導(dǎo)途徑調(diào)控細(xì)胞骨架重整，獲得了侵襲表型。結(jié)合我們之前已經(jīng)在ERK1/2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控肺癌侵襲和轉(zhuǎn)移方面開展的相關(guān)系列研究基礎(chǔ)[7,18]，我們推測ERK1/2信號傳導(dǎo)參與mERβ介導(dǎo)的MISS傳導(dǎo)途徑，從而調(diào)控A549細(xì)胞的遷移和侵襲。本研究結(jié)果檢測出β-estradiol可以經(jīng)mERβ快速激活ERK1/2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制ERK1/2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可以逆轉(zhuǎn)β-estradiol促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲。以上揭示了mERβ通過調(diào)控ERK1/2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)促進(jìn)A549細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移，與Verma等[19]和Hershberger等[20]研究報(bào)道m(xù)ERβ經(jīng)ERK1/2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖結(jié)果相似。以上研究結(jié)果揭示了β-雌二醇經(jīng)ERβ-ERK1/2雌激素胞膜信號傳導(dǎo)途徑促進(jìn)肺癌A549細(xì)胞遷移和侵襲，ERK1/2是ERβ雌激素胞膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中與肺癌侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的重要信號節(jié)點(diǎn)。然而研究尚存著較多的不足之處。首先，目前ERβ拮抗劑主要針對NISS途徑，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中尚需使用siRNA 敲低ERβ表達(dá)，深入驗(yàn)證ERβ通過調(diào)控MISS促進(jìn)肺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移；其次，本研究僅僅選取了A549一個(gè)細(xì)胞系，考慮到實(shí)驗(yàn)的可靠性，以后勢必要在多種肺癌細(xì)胞系中進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述，本研究初步闡明了ERβ在肺癌A549細(xì)胞中的表達(dá)和胞膜分布，顯示了ERK1/2是ERβ調(diào)控雌激素胞膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)并參與肺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵信號傳導(dǎo)節(jié)點(diǎn)，進(jìn)一步深入揭示了肺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。