楊玉婷，黎有有，吳秋蕾，樊 林，劉 荷，趙 湖，賀建武，劉祝祥，陳義光

(1.吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,湖南吉首416000； 2.酒鬼酒股份有限公司,湖南吉首416000)

白酒是我國特有的一種蒸餾酒，是世界六大蒸餾酒之一，由淀粉或糖質(zhì)原料制成酒醅或發(fā)酵后經(jīng)蒸餾而得。所謂“千年老窖萬年糟，酒好需得窖池老”，窖池中富含多種微生物和微量元素，對于白酒質(zhì)量和風(fēng)格的形成起著決定性的作用[1]。酒鬼酒在秉承湘西傳統(tǒng)小曲酒生產(chǎn)的基礎(chǔ)上，大膽吸納中國傳統(tǒng)大曲酒生產(chǎn)工藝的精髓，將小曲酒生產(chǎn)工藝和大曲酒生產(chǎn)工藝巧妙融合，待小曲培菌糖化完成后，將糖化谷類原料進(jìn)行配糟、加大曲，入泥池續(xù)糟發(fā)酵。由于糖化料的加入，使參與窖內(nèi)發(fā)酵的微生物種類、數(shù)量、活性等都發(fā)生了顯著的變化，與濃香型白酒窖內(nèi)發(fā)酵有很大的區(qū)別，這種獨(dú)特的生產(chǎn)工藝使酒鬼酒集濃、清、醬三大香型于一身，具備獨(dú)特的馥郁香型[2]。

據(jù)文獻(xiàn)報道，芽孢桿菌在白酒的釀造過程中起著重要的作用。在白酒生產(chǎn)釀造微生物細(xì)菌中，優(yōu)勢菌為芽孢桿菌屬（Bacillus）[3-9]。白酒釀造過程中，芽孢桿菌參與了釀造的各個環(huán)節(jié)，不僅分泌淀粉酶等水解酶類，參與釀酒原料中大分子物質(zhì)的分解，而且是白酒香味物質(zhì)的主要產(chǎn)生者。以茅臺為代表的醬香型白酒采用高溫制曲，并在入窖發(fā)酵前有特殊的堆積開放發(fā)酵工藝，其主要的生香微生物為耐高溫好氧芽孢桿菌[10-11]。本研究選取酒鬼酒窖池成熟酒醅，用純培養(yǎng)法分離其中的芽孢桿菌，采用基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析法研究這些分離菌株的多樣性，并對胞外酶學(xué)特征進(jìn)行觀察，為深入了解酒鬼酒獨(dú)特馥郁香型的形成原理和酒鬼酒釀造工藝的進(jìn)一步優(yōu)化提供理論和實(shí)踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器和試劑

樣品：酒鬼酒生產(chǎn)使用窖池成熟酒醅。

儀器設(shè)備及耗材：高壓滅菌鍋（MLS-3780，SANYO）；生物安全柜（BSC-04IIB2，蘇凈安泰）；恒溫培養(yǎng)箱（IS-RDD3，CRYSTAL）；恒溫震蕩培養(yǎng)箱（IS-RDVL，CRYSTAL）；顯微鏡（AB210-T，Motic）；冷凍干燥儀（HETOLL1500，捷克）；離心機(jī)（Centrifuge-5424，Eppendorf）；PCR擴(kuò)增儀（TC-4000，TECHNE）；凝膠成像儀(1600R，Tanon)；電泳儀（Powerpac-HV，BIO-RAD)；DNA 純度檢測儀（Biophotometer，Eppendoff）；細(xì)菌 16S rRNA 基因PCR擴(kuò)增所用酶、引物和試劑購自上海生物工程有限公司（Sangon Biotech）等。

1.2 培養(yǎng)基

共采用以下2種培養(yǎng)基為分離和純化培養(yǎng)基，均加制霉菌素100 mg/L抑制霉菌生長，加10%酒鬼酒酒醅浸汁配制，倒平板用于分離：

（1）營養(yǎng)瓊脂(nutrient agar,NA)：蛋白胨10 g，牛肉膏粉3 g，NaCl 5 g，瓊脂15 g，酒鬼酒酒醅浸汁100 mL，水900 mL，pH7.2～7.4。

（2）LB（Luria-Bertani）agar（LA）：胰蛋白胨10 g，酵母膏5 g，NaCl 10 g，瓊脂15 g，酒鬼酒酒醅浸汁100 mL，水900 mL，pH7.0。

酒醅浸汁制備：根據(jù)采樣情況，從每份樣品中取出等額量酒醅，混合均勻，稱取1000 g，加去離子水2000 mL，常規(guī)滅菌30 min，3層紗布過濾，濾液即為酒醅浸汁，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品采集與處理

采用5點(diǎn)法對酒鬼酒的酒醅進(jìn)行采集，自上而下，按3層分別采集，同一層面按中心部和周邊部5點(diǎn)取樣，周邊樣點(diǎn)離窖池壁20 cm。無菌密封，4 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離。每份樣品混勻去雜，各取50 g用滅菌信封包裹，室溫自然風(fēng)干14 d。風(fēng)干樣品110℃加熱處理1 h，研碎混勻，每份樣品取10 g混勻成一個混合樣品。取10 g混合樣，置于已滅菌盛有90 mL去離子水和玻璃珠的三角瓶中，15℃、180 r/min振蕩30 min，制成10-1樣品原液，然后做10倍梯度稀釋至10-7。

1.3.2 菌株分離

取200 μL 10-4～10-63個梯度稀釋液涂布NA和LA平板，倒置在28℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)7～14 d。菌落計(jì)數(shù)后，挑取單菌落用相應(yīng)培養(yǎng)基進(jìn)行四分體劃線純化4～5次，所得純培養(yǎng)物制成凍干牛奶管，并接種于相應(yīng)培養(yǎng)基斜面，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 表型特征觀察

菌株的菌落形態(tài)、細(xì)胞顯微形態(tài)、芽孢觀察及胞外酶學(xué)特性觀察按照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》推薦的方法進(jìn)行[12]。

1.3.4 基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

細(xì)菌基因組DNA的提取、16S rRNA基因的PCR 擴(kuò)增按Hernán-Gómez等[13]使用的方法進(jìn)行。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至上海生物工程有限公司進(jìn)行序列測定。根據(jù)所測序列結(jié)果，在EzBioCloud's Identify Service[14]和 NCBI網(wǎng)站運(yùn)用Blast搜索程序從GenBank/EMBL/DDBJ等公共數(shù)據(jù)庫進(jìn)行相似性搜索，調(diào)取與其相似性高的相關(guān)典型菌株的16S rRNA基因序列組成序列集，用Clustal W[15]軟件進(jìn)行序列多重比對，使用BioEdit軟件[16]進(jìn)行序列剪輯，根據(jù)Kimura[17]模型估算系統(tǒng)進(jìn)化距離矩陣，用MEGA4軟件包采用鄰接法(Neighborjoining method)進(jìn)行聚類分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建[18]。重復(fù)取樣1000次進(jìn)行自展值(bootstrap value)分析，以評估系統(tǒng)進(jìn)化樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)穩(wěn)定性[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離純化

表1 分離自酒鬼酒窖池酒醅芽孢桿菌菌株的形態(tài)特征

根據(jù)菌落大小、形態(tài)、顏色等特征，挑取分離平板上的單菌落進(jìn)行四分體劃線純化，從本次采集的樣品中共分離到104株細(xì)菌菌株。再根據(jù)細(xì)胞形態(tài)和產(chǎn)芽孢特征，去除部分冗余，選定28株代表性芽孢桿菌進(jìn)行進(jìn)一步研究（表1）。

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，這28株芽孢桿菌代表性菌株具有較高的類群多樣性和物種多樣性，分屬于細(xì)菌域（Bacteria）厚壁菌門（Firmicutes）的2個科（Bacillaceae、Paenibacillaceae）的 3 個屬（Bacillus、Brevibacillus、Virgibacillus），分為10個物種。芽孢桿菌屬（Bacillus）占絕對優(yōu)勢，共26株（92.9%）；其余2株JSM 161009和JSM 166025分屬于枝芽孢桿菌屬（Virgibacillus）和短芽孢桿菌屬（Brevibacillus）（表2）。

表2 分離自酒鬼酒窖池酒醅芽孢桿菌菌株的系統(tǒng)發(fā)育分析

2.3 分離菌株胞外酶學(xué)特征

對酒鬼酒窖池樣品中分離純化得到的28株代表性芽孢桿菌進(jìn)行產(chǎn)淀粉酶、酯酶、明膠酶和脲酶活性觀察。結(jié)果表明，至少產(chǎn)生1種酶的菌株共27株，占測試菌株的96.4%。其中有20株（71.4%）對淀粉水解作用陽性，19株（67.9%）對明膠有水解作用，27株（96.4%）對尿素有水解作用；有21株（75.0%）對4種吐溫（20、40、60、80）之一水解陽性，其中有 3株（JSM 161009、JSM 163017、JSM 168019；10.7%）對4種吐溫均有水解作用（表3）。在28株受試菌株中，有8株（JSM 161009、163010、163017、166014、167011、167021、168017、168019）水解酶譜較廣（表3）。

系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，這8株水解酶譜較廣的菌株均屬于芽孢桿菌科（Bacillaceae），其中1株（JSM 161009）屬于枝芽孢桿菌屬（Virgibacillus），其他7株均屬于芽孢桿菌屬（Bacillus）（表2、圖1）。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)以酒鬼酒窖池酒醅為研究對象，分離純化其中的芽孢桿菌，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析和胞外水解酶學(xué)特征觀察。結(jié)果表明，分離純化篩選所得到的28株代表性芽孢桿菌屬于厚壁菌門（Firmicutes）的2個科（Bacillaceae、Paenibacillaceae）的3個屬。菌株JSM 161009屬于枝芽孢桿菌屬（Virgibacillus），JSM 166025屬于短芽孢桿菌屬（Brevibacillus），其他26株皆屬于Bacillus。高溫大曲中的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）與醬香香氣的形成有著非常密切的關(guān)系[20]，張榮[21]篩選得到的產(chǎn)醬香細(xì)菌屬于地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）。本次實(shí)驗(yàn)沒有分離到地衣芽孢桿菌，但分離得到了枯草芽孢桿菌和其他7種芽孢桿菌屬（Bacillus）菌株，以及枝芽孢桿菌屬（Virgibacillus）和短芽孢桿菌屬（Brevibacillus）各一種。這些結(jié)果說明酒鬼酒窖池中芽孢桿菌類群多樣性和物種多樣性較高。我們進(jìn)一步對這28株菌株進(jìn)行產(chǎn)胞外水解酶分析，結(jié)果表明，這些芽孢桿菌菌株普遍能產(chǎn)生多種胞外水解酶。在釀造發(fā)酵工藝中，淀粉酶對釀造原料進(jìn)行糖化[22]，酯酶是形成傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)品風(fēng)味物質(zhì)的基礎(chǔ)[23]，明膠酶對酒體澄清起著重要作用[24]，脲酶能降低酒中EC含量[25]。本次實(shí)驗(yàn)所篩選到的芽孢桿菌在酒鬼酒的釀造形成過程中究竟起著怎樣的具體作用，對酒鬼酒獨(dú)特的馥郁香型的形成有哪些貢獻(xiàn)，值得進(jìn)一步研究。

表3 分離自酒鬼酒窖池酒醅芽孢桿菌的胞外酶學(xué)特征觀察

圖1 基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的分離自酒鬼酒窖池酒醅水解酶譜較廣的8株芽孢桿菌的系統(tǒng)發(fā)育樹