羅小葉 ，王曉丹 ，邱樹毅

（1.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州貴陽550025； 2.貴州大學貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州貴陽550025）

我國傳統(tǒng)白酒是世界上最古老的蒸餾酒之一，其主要以富含淀粉質(zhì)的糧食為原料，經(jīng)過固態(tài)、半固態(tài)及液態(tài)等方式發(fā)酵、蒸餾而成。醬香型白酒是中國蒸餾酒的重要香型之一，它采用獨特的釀造工藝，高溫制曲、高溫堆積、高溫發(fā)酵、高溫餾酒和長期貯存，此外，其釀造工藝還包括2次投料、9次蒸煮、8次發(fā)酵、7次取酒，長時間分輪次、分香型貯存后，精心勾調(diào)而成[1]。茅臺酒是醬香型白酒的典型代表，是世界三大（蒸餾）名酒之一，以其香氣幽雅、酒體醇厚豐滿、回味悠長、空杯留香持久的特點深受廣大消費者的青睞，是中國優(yōu)質(zhì)白酒的典范。

微生物的種類及數(shù)量對醬香型白酒的風味有著特殊的關系，直接參與了醬香型白酒風味物質(zhì)的形成。本文介紹了本課題組對醬香型白酒從制曲、堆積到窖內(nèi)發(fā)酵過程中各類微生物的研究情況，通過免培養(yǎng)和可培養(yǎng)的方法對整個釀造過程各類微生物的菌群結構及主要功能菌進行分析，從多角度認識醬香型白酒生產(chǎn)過程中的各類微生物，對揭示醬香型白酒發(fā)酵機理及提高白酒質(zhì)量有一定的借鑒，亦對控制醬香型白酒生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性和規(guī)范性具有指導意義。

1 醬香酒中的細菌研究

細菌作為醬香白酒主要微生物類群之一，在整個釀造過程中呈現(xiàn)出種類與功能多樣性的特點，是發(fā)酵生香的動力來源，細菌菌群結構特征直接影響著代謝產(chǎn)物的形成，多年來針對細菌類群結構的分析一直是研究熱點。

1.1 免培養(yǎng)方法分析醬香大曲細菌菌群結構

王曉丹等[2]研究了茅臺鎮(zhèn)醬香白酒7個企業(yè)大曲細菌菌群結構，采用高通量測序技術對樣品細菌種群進行分析，得到的在各分類水平上的物種組成比例以及群落結構的情況見表1。

表1 醬香大曲細菌類群分析

研究表明，細菌類群分析平均92%以上的序列可以注釋在科水平，有70%的序列可以注釋到屬的水平，確定醬香大曲細菌的組成以厚壁菌門（87.3%～91.8%）為主要類群，并發(fā)現(xiàn)了未曾報道過的藍細菌門（0.1%～1.5%），其中芽孢桿菌屬占細菌總量的60%以上，在醬香大曲細菌類群分析中屬優(yōu)勢種類。

1.2 可培養(yǎng)方法分析醬香大曲細菌菌群結構及功能特性

肖蓓[3]、王婧[4]采用可培養(yǎng)稀釋平板法分析茅臺鎮(zhèn)醬香白酒7個企業(yè)大曲細菌群落組成，從大曲樣品中共分離出47株細菌，鑒定結果見表2。

表2 醬香大曲細菌種類

其中，地衣芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌在大曲中的含量都比其他細菌多，是典型的嗜熱芽孢桿菌，也是大曲中產(chǎn)醬香功能細菌，初步推測為地域性微生物類群。

肖蓓[3]對大曲樣品中分離純化篩選出的上述可培養(yǎng)細菌，進行產(chǎn)酶實驗，結果表明，篩選出的可培養(yǎng)細菌可產(chǎn)生酸性蛋白酶、糖化酶、纖維素酶、果膠酶及脂肪酶，不同種類的細菌產(chǎn)酶種類及酶活大小差異較大。結果見表3。

其次王婧[4]對可培養(yǎng)細菌進行模擬固態(tài)發(fā)酵并采用GC-MS聯(lián)用儀對揮發(fā)性成分進行分析，結果如表4所示，表明各株細菌的發(fā)酵產(chǎn)物豐富，其中四甲基吡嗪和香味物質(zhì)乙偶姻含量較高。并從中篩選出產(chǎn)吡嗪類物質(zhì)相對較高的地衣芽孢桿菌，應用到麩曲醬香型白酒生產(chǎn)中，并通過正交試驗優(yōu)化發(fā)酵條件，提高麩曲醬香型白酒酒質(zhì)，增加了醬香風味。

1.3 可培養(yǎng)方法分析醬香酒釀造過程細菌菌群結構及功能特性

張小龍[5]以貴州遵義某釀酒有限公司提供酒醅為實驗材料，通過平板劃線的方法從酒醅中細菌進行分離篩選，經(jīng)鑒定主要為地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、彎曲芽孢桿菌等種類。

篩選到的細菌通過模擬固態(tài)發(fā)酵并利用GCMS聯(lián)用儀分析產(chǎn)醬香濃郁的細菌的固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物，結果見表5，表明產(chǎn)物中芳香族及雜環(huán)類化合物含量較高，其中四甲基吡嗪含量最高，這賦予醬香型白酒以濃郁突出的醬香風味。

表3 細菌5種酶酶活測定結果 (U/mL)

表4 地衣芽孢桿菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物比例 (%)

表5 地衣芽孢桿菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物比例 (%)

1.4 醬香酒中嚴格厭氧的細菌菌群結構及功能特性

酒醅微生物區(qū)系是白酒釀造體系中微生物多樣性研究的重點，其產(chǎn)生的酶類、酯類、酸類是構成酒體風味物質(zhì)的前提。而厭氧培養(yǎng)由于技術繁瑣，耗費財力而成為厭氧微生物研究的瓶頸，所以目前關于醬香白酒釀造過程中厭氧細菌的報道很少。曾超[6]采用較簡單便捷的厭氧手套箱法來對釀造酒醅中厭氧細菌進行分離培養(yǎng)，結果在厭氧工作站中，利用平板劃線法對各輪次酒醅進行分離篩選，從酒醅中分離出7株嚴格厭氧菌，經(jīng)鑒定為解木聚糖梭菌(Clotridium xylanolyticum)、煎盤梭菌(Clostridium sartagoformum)、丁酸梭菌（Clostridium butyricum）、近端梭菌（Clostridium clostridiiforme）。此外通過對嚴格厭氧菌進行模擬固態(tài)發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)木聚糖梭菌、煎盤梭菌2株嚴格厭氧菌具有很強的醬香氣味，通過GC-MS聯(lián)用儀對揮發(fā)性成分進行分析，其中含量較高的吡嗪類化合物是產(chǎn)生醬香味的主要物質(zhì)。課題組通過對醬香型白酒釀造過程中厭氧菌的研究為今后深入探討其功能提供一定基礎。

2 醬香酒中的高溫放線菌與放線菌

2.1 免培養(yǎng)方法分析醬香大曲高溫放線菌菌群結構

高溫放線菌分類地位屬于細菌域（Domain Bacteria）、厚壁菌門（Phylum Firmicutes）、芽孢桿菌綱（Class Bacilli）、芽孢桿菌目（Order Bacillales）、高溫放線菌科（Thermoactinomycetaceae）[7]。王曉丹[8]采用第二代高通量測序的方法對醬香大曲細菌的多樣性進行了分析，同時發(fā)現(xiàn)高溫放線菌的平均相對含量占34.40%，且不同企業(yè)大曲樣品的高溫放線菌含量有差異（表6）。采用免培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn)，高溫放線菌屬和芽孢桿菌屬同為醬香型大曲主要優(yōu)勢菌群，推測高溫放線菌在醬香型大曲中同樣扮演了重要的角色。

表6 不同企業(yè)醬香大曲高溫方放線菌與芽孢桿菌科含量對比 (%)

2.2 可培養(yǎng)方法分析醬香大曲高溫放線菌菌群結構及功能特性

李豆南[9]、羅小葉[10]從茅臺鎮(zhèn)某醬香酒企業(yè)成品曲中采用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法對樣品中高溫放線菌進行分離培養(yǎng)，結果從中分離鑒定出5株高溫放線菌，分別為：嗜溫高溫放線菌（Thermoactinomyces thalpohillus）、甘蔗高溫放線菌（Thermoactinomyces sacchari)、甘蔗萊斯氏菌（Laceyella sacchari）。模擬固態(tài)發(fā)酵和分析揮發(fā)性成分，結果顯示，揮發(fā)性成分組成主要以醇類、醛類、酮類、烷烴類、酯類、萜烯類物質(zhì)為主，其在感官品評方面表現(xiàn)出醬味和土霉異味，揮發(fā)性產(chǎn)物檢測到的表現(xiàn)醬味的吡嗪類物質(zhì)及表現(xiàn)出土霉異味的二甲萘烷醇。上述研究對了解這一種屬在醬香大曲中的作用是非常必要的，也填補了高溫放線菌分離篩選及其功能研究的空白。

2.3 免培養(yǎng)方法分析醬香大曲放線菌菌群結構

王曉丹[2]采用高通量測序的方法對茅臺鎮(zhèn)醬香白酒7個企業(yè)大曲微生物菌群結構進行探究，分析結果表明，檢測到放線菌門的微生物占一定比例，主要為纖維素單胞菌科、分支桿菌科、諾卡菌科、鏈霉菌科、微球菌科、高溫單孢菌科、丙酸桿菌科、短桿菌科、多孢放線菌科等科的放線菌，其中糖多孢菌屬的平均相對含量最高，為9.2%。

2.4 可培養(yǎng)方法分析醬香大曲放線菌菌群結構及功能特性

對于傳統(tǒng)白酒生產(chǎn)領域有關放線菌研究，主要集中在白酒發(fā)酵過程中酒醅、窖泥、發(fā)酵池、曲房和窖房空氣中放線菌的分離及鑒定，羅小葉等探究醬香酒大曲中放線菌資源及功能，從中分離鑒定出了3株放線菌分別為可可鏈霉菌（Streptomyces cacaoi）、沙阿霉素鏈霉菌（Streptomyces zaomyceticus），同時對其產(chǎn)酶產(chǎn)香特性進行相關研究，見表7。結果表明，3株菌產(chǎn)果膠酶較為突出，固態(tài)發(fā)酵揮發(fā)性成分分析見圖1。主要以酯類物質(zhì)為主，且均能產(chǎn)生吡嗪類物質(zhì)。

表7 放線菌5種酶酶活力測定結果 (U/g)

圖1 醬香大曲中鏈霉菌揮發(fā)性成分分析

3 醬香酒中的酵母菌

酵母是白酒釀造微生物家族中不可或缺的一類微生物，從醬香型白酒制曲到釀造過程一直可以檢測出，直接關系到產(chǎn)酒率，且能夠代謝產(chǎn)生大量不同的風味物質(zhì)，對醬香型白酒風格的形成具有重要作用。對醬香型白酒大曲和釀造過程中的酵母進行研究，揭示釀造工藝中酵母消長規(guī)律及群落結構，認識微生態(tài)環(huán)境中酵母作用及其與微生態(tài)環(huán)境中各種微生物之間的代謝關系，能進一步發(fā)揮酵母資源在白酒生產(chǎn)中的作用，提高酵母生物經(jīng)濟學價值，也為深入研究醬香型白酒發(fā)酵機理及呈香機制提供基礎數(shù)據(jù)和理論依據(jù)，并對實際生產(chǎn)具有指導意義[11]。

3.1 免培養(yǎng)方法分析醬香大曲酵母菌菌群結構

王曉丹[2]采用高通量測序的方法對茅臺鎮(zhèn)醬香白酒7個企業(yè)大曲酵母菌菌群結構進行探究，分析檢測到子囊菌門、酵母綱、酵母目下的酵母菌，如表8所示，其中畢赤酵母屬和復膜孢酵母屬的酵母種類平均相對含量最高，此外各個企業(yè)的酵母菌群結構及含量均有一定差異。

3.2 可培養(yǎng)方法分析醬香白酒釀造過程酵母菌菌群結構及功能特性

醬香型白酒高溫制曲工藝雖然會限制酵母菌的生長和繁殖，但是仍然有部分酵母可能處于存活或者休眠狀態(tài)，并且成品曲出房后及貯存過程中，在常溫條件下繼續(xù)網(wǎng)羅周圍環(huán)境中的酵母，因而醬香型白酒高溫大曲中仍含有一定數(shù)量的酵母[11]。課題組孔維兵[12]、陳美竹[13]、龐博[14]采用可培養(yǎng)方法對醬香型白酒釀造過程中的酵母菌進行分離篩選和功能特性研究，結果見表9。

表8 免培養(yǎng)方法分析不同企業(yè)醬香大曲酵母菌菌群結構

表9 可培養(yǎng)方法分析酵母菌菌群結構及特性

4 醬香酒中的絲狀真菌

醬香型白酒獨特的釀造工藝形成了獨特的微生物群落，其中霉菌是醬香大曲中一類比較重要的微生物，種類豐富，能夠分泌多種酶類和代謝產(chǎn)物，對醬香型白酒獨特的同步糖化發(fā)酵釀造方式和風味物質(zhì)的形成有重要影響。

4.1 免培養(yǎng)方法分析醬香大曲絲狀真菌菌群結構

王曉丹[2]通過高通量測序分析茅臺鎮(zhèn)醬香白酒7個企業(yè)大曲樣品霉菌種群結構，分析結果如表10所示，大曲樣品中曲霉屬、根霉屬及橫梗霉屬3個屬的霉菌相對含量明顯高于其他屬類，此外不同企業(yè)的霉菌在種類及數(shù)量上有一定差異。

4.2 可培養(yǎng)方法分析醬香大曲絲狀真菌菌群結構及功能特性

表10 免培養(yǎng)方法分析不同企業(yè)醬香大曲霉菌菌群結構

表11 可培養(yǎng)方法分析霉菌菌群結構及特性

班世棟[15]、徐佳[16]對貴州某醬香型白酒生產(chǎn)企業(yè)醬香型大曲中霉菌進行研究，分別研究白曲、黃曲和黑曲不同儲藏時間的大曲霉菌的數(shù)量變化、可培養(yǎng)霉菌的種類及產(chǎn)酶情況。結果表明，大曲在儲藏過程中，白曲的霉菌數(shù)量最多，黃曲和黑曲的數(shù)量相差較小，總共分離到28株霉菌，見表11。通過研究醬香大曲的霉菌種類及數(shù)量，結合可培養(yǎng)霉菌的酶活體系，為衡量大曲品質(zhì)，完善制曲工藝的操作控制生產(chǎn)高品質(zhì)大曲提供參考依據(jù)，也為強化大曲提供研究基礎。

5 展望

醬香白酒作為中國白酒重要香型，擁有獨特的生產(chǎn)工藝和別具一格的風味，以及獨特的魅力，對醬香白酒的研究也具有很高的理論價值和市場價值。

采用可培養(yǎng)方法和免培養(yǎng)技術來分析醬香白酒整個釀造過程的微生物菌群結構，從物種分類水平上詳細描述了醬香白酒釀造過程各類微生物群落的特征性結構，每個企業(yè)的微生物類群組成都具有各自的特點，根據(jù)微生物類群組成分離篩選特征微生物和功能微生物，為今后醬香白酒微生物多樣性及功能性的深入研究提供了新的思路。隨著對醬香白酒相關研究的增多，積累了豐富的基礎數(shù)據(jù)，醬香白酒的研究在不斷向前發(fā)展。