管 健，廖 蓓，常 煦，曹敬華，陳茂彬，方尚玲

(1.湖北工業(yè)大學(xué)湖北省工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢430068； 2.安琪酵母股份有限公司，湖北宜昌443000)

研究功能菌一般是為了彌補(bǔ)白酒中風(fēng)味成分的不足，傳統(tǒng)方法生產(chǎn)的大曲容易受到環(huán)境因素的影響。因此，通過(guò)白酒功能菌的使用，提高曲的利用效果，豐富白酒發(fā)酵過(guò)程中的微生態(tài)環(huán)境，從而使得各香型白酒骨架香味成分得到提高。近年來(lái)，隨著對(duì)白酒功能菌研究的不斷深入，從大曲或者窖泥中分離篩選出上千種微生物菌種，許多廠家開始將有益功能菌應(yīng)用于傳統(tǒng)白酒的生產(chǎn)中，以提高酒醅中微生物的種類和數(shù)量，提升白酒的質(zhì)量，并取得了一定的成果[1-3]。

本研究以槽車為發(fā)酵容器，按照大曲清香型白酒的生產(chǎn)工藝進(jìn)行發(fā)酵，對(duì)發(fā)酵過(guò)程中的理化指標(biāo)和酒質(zhì)進(jìn)行比較，以期為功能菌在大曲清香型白酒釀造生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

原料及曲樣：紅高粱、谷殼、麩皮，從武泰閘糧油市場(chǎng)購(gòu)買；清香大曲，由湖北某酒廠提供；強(qiáng)化麩曲，將酯化紅曲、生香酵母和釀酒酵母分別接種于麩皮制備成強(qiáng)化麩曲。

試劑：氫氧化鈉、酚酞指示劑、斐林試劑、葡萄糖、1∶4鹽酸溶液，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

儀器設(shè)備：不銹鋼槽車，煙臺(tái)良榮機(jī)械精業(yè)有限公司；GC7980氣相色譜儀，上海天美科學(xué)儀器有限公司；HH-4水浴鍋，常州國(guó)華電器有限公司；AR 1140電子分析天平，奧克斯國(guó)際貿(mào)易有限公司；PHX智能生化恒溫培養(yǎng)箱，寧波萊?？萍加邢薰?；pH計(jì)，Ultra BASIC公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 釀造工藝（圖1）

圖1 大曲清香型大米查酒生產(chǎn)工藝流程

按參考文獻(xiàn)[4]的釀造工藝流程進(jìn)行試驗(yàn)，分為兩組試驗(yàn)，每組投糧300 kg，以槽車發(fā)酵的方式進(jìn)行試驗(yàn)；試驗(yàn)組工藝步驟與對(duì)照組相同，但分別按比例添加強(qiáng)化麩曲，強(qiáng)化麩曲的總添加量為原料的0.2%，其他工藝步驟和參數(shù)均保持一致。

1.2.2 理化指標(biāo)測(cè)定

酒醅從槽車的四個(gè)角部位及中間的上、中、下層取樣，混合均勻后，作為供試樣品，每隔5 d取樣1次。分別檢測(cè)兩組試驗(yàn)糟醅的溫度、水分、酸度、淀粉含量和還原糖含量[5]，用電子溫度計(jì)測(cè)定溫度，水分采用常壓干燥法測(cè)定，酸度采用酸堿中和法測(cè)定，淀粉含量采用鹽酸水解法測(cè)定，標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液采用反滴定法測(cè)定。

1.2.3 白酒風(fēng)味物質(zhì)分析

（1）預(yù)處理

對(duì)基酒用0.22 μm的濾膜進(jìn)行過(guò)濾。

（2）色譜條件

氣相色譜儀：GC7980；色譜柱：DB-WAX；檢測(cè)器：FID；檢測(cè)器溫度：220 ℃；柱流量：0.79 mL/min；分流比：40∶1；進(jìn)樣口溫度：200 ℃；進(jìn)樣量：0.6 μL；柱溫條件：初始溫度35℃，維持5 min，以4℃/min升到60℃，后以6℃/min升到105℃，再以3℃/min升到125℃，最后以10℃/min升到200℃，維持8 min。

（3）內(nèi)標(biāo)的配制

準(zhǔn)確量取乙酸正戊酯內(nèi)標(biāo)色譜純單體溶液各0.2 mL，用60%vol乙醇基體溶液定容到10 mL容量瓶中，并盡快封閉樣品瓶。標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確量取單標(biāo)及內(nèi)標(biāo)混合溶液各2 mL，用60%vol乙醇溶液定容到100 mL容量瓶中，充分混勻后即可供進(jìn)樣。

（4）定性定量分析

配制40組分混標(biāo)，以各單標(biāo)進(jìn)行定性，得到各混標(biāo)峰信息，以乙酸正戊酯為內(nèi)標(biāo)，使其在混標(biāo)和各樣品內(nèi)的終濃度為350.24 mg/L，建立分析方法，用于樣品的定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過(guò)程理化指標(biāo)的分析

2.1.1 大米查發(fā)酵過(guò)程中酒醅溫度變化規(guī)律

對(duì)槽車酒醅溫度變化情況進(jìn)行跟蹤監(jiān)測(cè)，可以得到發(fā)酵過(guò)程中酒醅的溫度變化曲線，如圖2所示。

圖2 發(fā)酵過(guò)程中酒醅溫度變化曲線

酒醅的溫度趨勢(shì)是先上升后下降。在發(fā)酵的前期，溫度快速的升高，到入缸15 d時(shí)，溫度達(dá)到最高點(diǎn)，分別為30.7℃和31.6℃；發(fā)酵15 d到20 d，溫度又有所下降。在發(fā)酵前期，由于淀粉被分解，還原糖含量的增加，使得細(xì)菌和酵母大量增殖，大量的生物熱得到釋放，由于白酒的固態(tài)發(fā)酵，熱量傳遞的速度較慢，溫度容易積累；發(fā)酵中期，微生物生長(zhǎng)完畢，主要進(jìn)行產(chǎn)乙醇的階段，生物熱能較少，由于酒醅的溫度與環(huán)境溫度差異較大，傳熱較快，導(dǎo)致生物熱散失，溫度下降；發(fā)酵20 d后，由于酒醅溫度與周圍環(huán)境基本一致，所以散熱較少，溫度基本維持恒定。發(fā)酵前中期，試驗(yàn)組升溫速度要明顯高于對(duì)照組。

2.1.2 大米查發(fā)酵過(guò)程中酒醅水分變化規(guī)律

對(duì)槽車酒醅的水分含量進(jìn)行監(jiān)測(cè)，得到大渣發(fā)酵過(guò)程中酒醅的水分含量變化曲線，如圖3所示。

圖3 發(fā)酵過(guò)程中酒醅水分含量變化曲線

在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，水分含量的變化是先上升后平穩(wěn)再上升。從入缸到發(fā)酵10 d水分上升較快；發(fā)酵10 d到15 d，水分變化的速度稍有下降；15 d到20 d，水分又有明顯上升。功能麩曲的添加促進(jìn)微生物生長(zhǎng)和發(fā)酵，使得酒醅水分增速稍快。在發(fā)酵前期，由于淀粉水解，生成酒精，同時(shí)產(chǎn)生大量二氧化碳，使得水分增加；發(fā)酵20 d后可能由于一些菌體的分解自溶，和一些產(chǎn)酸菌的代謝產(chǎn)生相應(yīng)的水分，使水分含量略有升高。

2.1.3 大米查發(fā)酵過(guò)程中酒醅淀粉變化規(guī)律（圖4）

圖4 發(fā)酵過(guò)程中酒醅淀粉含量變化曲線

在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，酒醅中淀粉含量的變化呈下降趨勢(shì)，但下降的趨勢(shì)逐漸變緩，前期下降速度較快，后期下降趨勢(shì)較慢，在發(fā)酵初期，淀粉下降速度最快。功能麩曲的添加使得淀粉的消耗速度要快于對(duì)照組。發(fā)酵前期，由于淀粉酶的作用，淀粉快速分解成葡萄糖，同時(shí)葡萄糖在酵母菌的作用下轉(zhuǎn)化為酒精，因此淀粉含量下降速度較快；發(fā)酵中期，隨著霉菌的消失和淀粉酶的分解、淀粉含量的減少，使淀粉水解的速率相對(duì)降低，同時(shí)由于酵母代謝減緩，導(dǎo)致還原糖的積累，形成反饋?zhàn)瓒?，使淀粉水解速率下降；發(fā)酵后期淀粉基本上被分解完全，只有少量的耐酸性細(xì)菌由于生長(zhǎng)需要產(chǎn)生少量淀粉酶，使淀粉含量略有下降。

2.1.4 大米查發(fā)酵過(guò)程中酒醅還原糖變化規(guī)律（圖5）

圖5 發(fā)酵過(guò)程中酒醅還原糖含量變化曲線

如圖5所示，發(fā)酵10 d時(shí)為分界點(diǎn)，10 d前的還原糖含量呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，10 d后呈下降趨勢(shì)，10 d時(shí)還原糖最高，分別為2.21%和2.43%。功能菌的添加使得還原糖的增速更大，有利于乙醇的產(chǎn)生。發(fā)酵前期，在霉菌和淀粉酶的作用下淀粉快速水解為還原糖，并且其水解速率要大于還原糖轉(zhuǎn)變?yōu)榫凭乃俾剩虼诉€原糖含量不斷積累增加；同時(shí)，到發(fā)酵10 d時(shí)，由于酒精含量的增加和酒醅環(huán)境的變化，霉菌的消失和淀粉酶的不斷分解，導(dǎo)致還原糖含量減少，而殘留的一部分酵母和細(xì)菌的生長(zhǎng)均需要葡萄糖，因此還原糖含量呈逐漸下降趨勢(shì)。

2.1.5 大米查發(fā)酵過(guò)程中酒醅酸度變化規(guī)律

發(fā)酵環(huán)境中的酒醅可看作一個(gè)緩沖體系，酸度的變化可作為微生物在特定環(huán)境中代謝活動(dòng)的一個(gè)指標(biāo)。對(duì)槽車酒醅的酸度進(jìn)行跟蹤監(jiān)測(cè)，可以得到發(fā)酵過(guò)程中酒醅的酸度變化曲線，如圖6所示。

圖6 發(fā)酵過(guò)程中酒醅酸度變化曲線

由圖6可知，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，酒醅的酸度逐漸升高，20 d后，酸度較大幅度提升。這主要是由于發(fā)酵前期的酒醅中氧含量較高，產(chǎn)酸菌繁殖速度快，產(chǎn)酸多，酸度增加快。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，酒醅中乙醇含量增大，酸度逐漸增高，產(chǎn)酸菌的繁殖代謝會(huì)受到一定程度的抑制，產(chǎn)酸速度逐漸下降，同時(shí)在中后期，在生物酶的催化作用下酸醇縮合產(chǎn)生酯類物質(zhì)也會(huì)大大降低酒醅的酸度，因此酸度增勢(shì)趨于平緩。發(fā)酵后期由于耐酸細(xì)菌的繼續(xù)繁殖，代謝產(chǎn)酸，導(dǎo)致后期酒醅酸度有一定程度上升。添加了功能菌的試驗(yàn)組的酒醅酸度趨勢(shì)大體和對(duì)照組相似，中期試驗(yàn)組的酸度略比對(duì)照組低，可能是由于中期試驗(yàn)組酒醅中乙醇濃度較高，抑制了產(chǎn)酸菌的生長(zhǎng)。

2.2 氣相色譜測(cè)定白酒風(fēng)味物質(zhì)

利用氣相色譜儀測(cè)定大米查白酒相關(guān)主要成分，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 菌種強(qiáng)化釀酒試驗(yàn)色譜測(cè)定結(jié)果 (mg/100 mL)

由表1可知，試驗(yàn)組原酒中與清香型白酒密切相關(guān)的成分，乙酸乙酯、乳酸乙酯等含量?jī)?yōu)于對(duì)照組，這與原酒的感官評(píng)價(jià)相契合，試驗(yàn)組原酒清香味明顯，而對(duì)照組的清香味寡淡、不突出。圖7和圖8分別是對(duì)照組和試驗(yàn)組白酒氣相色譜圖。

圖7 對(duì)照組氣相色譜圖

3 結(jié)論

3.1 分析檢測(cè)發(fā)酵過(guò)程中酒醅的溫度、水分、酸度、淀粉含量和還原糖含量變化，試驗(yàn)組的溫度和水分含量幾乎始終高于對(duì)照組，最高分別為31.6℃和62.4%；與對(duì)照相比，試驗(yàn)組由于添加了功能菌，對(duì)淀粉的利用程度比對(duì)照要高1.42%，發(fā)酵過(guò)程中的還原糖含量幾乎始終高于對(duì)照組，酒醅的糖化效果要優(yōu)于對(duì)照組。對(duì)照組和試驗(yàn)組的酸度隨發(fā)酵輪次增加呈上升趨勢(shì)，試驗(yàn)組成熟酒醅的酸度要稍微高于對(duì)照組。

圖8 試驗(yàn)組氣相色譜圖

3.2 試驗(yàn)組添加強(qiáng)化麩曲，豐富了發(fā)酵微生態(tài)體系，有利于風(fēng)味物質(zhì)的形成。對(duì)白酒進(jìn)行色譜分析發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組原酒中與清香型白酒密切相關(guān)的成分，乙酸乙酯、乳酸乙酯等含量?jī)?yōu)于對(duì)照組，這與原酒的感官評(píng)價(jià)相契合，試驗(yàn)組原酒清香味明顯，而對(duì)照組的清香味寡淡、不突出。