廖登未 黃德春 程抒劼 曹崇江 陳貴堂

(中國藥科大學(xué)工學(xué)院，江蘇 南京 211198)

姜(ZingiberofficinaleRosc)又稱百辣云、鮮生姜、姜根等，屬姜科植物，主要分布于中國四川、貴州、福建、湖北和兩廣等地[1]?，F(xiàn)代工藝研究發(fā)現(xiàn)，姜具有抗腫瘤[2-3]、抗氧化[4-5]和抗炎止痛[6]等藥理作用。此外，姜中富含多糖類物質(zhì)，且姜多糖具有抗氧化[7]、消炎抑菌[8]和抗疲勞[9]等生物活性。

在多糖的提取研究中，目前多采用熱水浸提法、超聲波提取法、酶提取法和微波提取等[10]方法。研究表明，即使同種原料，采用不同提取方法所得的多糖，其結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、單糖成分以及生物活性均有不同。比如，Zhang等[11]在生姜多糖的研究中，采用了酸式、中性以及堿式水提法，發(fā)現(xiàn)3種不同的提取方法得到的生姜多糖具有不同的抗氧化活性；韓冬屏等[12]研究顯示超聲波輔助提取法所得姜多糖得率和DPPH·的清除能力均優(yōu)于微波輔助提取和傳統(tǒng)熱水提取法的；在生姜粗、精多糖抗氧化試驗中，王蕓等[13]采用了水提法、超聲輔助酶解法以及酶解法，得出生姜粗多糖的還原能力大小關(guān)系為：超聲輔助酶解法>酶解法>水提法，而精多糖僅對DPPH·具有顯著影響。

透射電鏡具有分辨率高、放大倍數(shù)高、信息立體化等優(yōu)勢，近年來備受科研工作者的青睞。在不同方法提取姜多糖研究中，目前尚未有文獻(xiàn)報道利用透射電鏡觀察姜渣細(xì)胞破損情況，分析影響姜多糖得率的試驗研究。因此，本研究擬采用熱水浸提法、超聲波冰浴提取法、復(fù)合酶提取法3種方法對姜多糖進(jìn)行分離提取，利用透射電鏡和紫外-可見光分光光度計對姜渣和姜多糖進(jìn)行掃描分析，對比不同提取方法對姜多糖提取效果的影響，擬為進(jìn)一步深入研究不同方法所得姜多糖的結(jié)構(gòu)、物化特性以及生物學(xué)活性提供試驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

干姜片：產(chǎn)自云南，亳州市常富藥業(yè)有限公司，采用50 ℃ 減壓干燥，粉碎過篩60目備用；

纖維素酶(1 800 U/mg)、果膠酶(1 000 U/mg)：上海金穗生物科技有限公司；

木瓜蛋白酶：3 U/mg，阿拉丁試劑(上海)有限公司；

其它試劑均為國產(chǎn)分析純試劑；

搖擺式高速中藥粉碎機(jī)：DFY-500型，溫嶺市林大機(jī)械有限公司；

紫外—可見分光光度計：TU-1901型，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；

離心機(jī)：LXJ-IIB型，上海安亭科學(xué)儀器廠；

超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)：JY-92IIN型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

真空冷凍干燥機(jī)：PD-1C-50型，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；

分析天平：ATX224型，日本島津儀器公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：RE-5205型，上海亞榮生化儀器廠；

透射電鏡：HT7700型，日本日立公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 提取工藝流程

姜粉→提取(熱水浸提、超聲波冰浴提取、復(fù)合酶酶解)→離心(4 000 r/min，20 min)→過濾，取濾液，50 ℃旋蒸至原濾液1/4→sevag試劑(正丁醇與氯仿體積比4∶1)除蛋白→加入4倍體積無水乙醇靜置→離心(4 000 r/min，10 min)，得沉淀→丙酮、無水乙醇、乙醚各洗滌2次→減壓干燥，40 ℃→多糖成品

1.2.2 熱水浸提法

(1) 單因素試驗：探究熱水浸提時間、溫度、液料比對姜多糖提取率的影響。固定提取時間2 h，提取溫度70 ℃，設(shè)置液料比分別為10∶1，15∶1，20∶1，25∶1，30∶1，35∶1(mL/g)；固定提取時間2 h，液料比20∶1 (mL/g)，設(shè)置提取溫度分別為50，60，70，80，90，100 ℃；固定提取溫度90 ℃，液料比20∶1 (mL/g)，設(shè)置提取時間分別為1，2，3，4，5，6 h。

(2) 正交試驗設(shè)計：在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以多糖提取率為考察對象，采用正交試驗分析，優(yōu)化姜多糖最優(yōu)提取工藝參數(shù)。

1.2.3 超聲波冰浴提取法

(1) 單因素試驗：探究超聲時間、功率、液料比對姜多糖提取率的影響。固定液料比20∶1 (mL/g)，超聲功率200 W，設(shè)定超聲時間分別為20，25，30，35，40，45 min；固定液料比20∶1 (mL/g)，超聲時間35 min，設(shè)定超聲功率分別為100，200，300，400，500，600 W；固定超聲時間35 min，超聲功率500 W，設(shè)定液料比分別為10∶1，15∶1，20∶1，25∶1，30∶1，35∶1 (mL/g)。

(2) 正交試驗設(shè)計：在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以多糖提取率為檢測指標(biāo)，采用正交試驗分析，優(yōu)化姜多糖最優(yōu)提取工藝參數(shù)。

1.2.4 復(fù)合酶解法

(1) 單因素試驗：在纖維素酶用量63 000 U/g·底物，果膠酶用量20 000 U/g·底物，木瓜蛋白酶用量62.5 U/g·底物條件下，探究酶解條件對姜多糖提取效果的影響。固定酶解時間2 h，酶解溫度50 ℃，pH 5.0，設(shè)定液料比分別為15∶1，20∶1，25∶1，30∶1，35∶1，40∶1 (mL/g)；在酶解時間2 h，酶解溫度50 ℃，液料比25∶1 (mL/g)條件下，設(shè)定pH分別為3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0；固定酶解時間2 h，液料比25∶1 (mL/g)，pH 6.0，設(shè)定酶解溫度分別為30，40，50，60，70，80 ℃；固定液料比25∶1 (mL/g)，pH 6.0，酶解溫度50 ℃，設(shè)定酶解時間分別為1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5 h。

(2) 正交試驗設(shè)計：在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以多糖提取率為考察對象，采用正交試驗分析，優(yōu)化姜多糖最優(yōu)提取工藝參數(shù)。

1.2.5 多糖及蛋白含量測定 根據(jù)文獻(xiàn)[14]，采用苯酚-硫酸法測定多糖含量，考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白含量，并對計算方法進(jìn)行如下修改：

(1) 多糖提取率：按式(1)計算。

(1)

式中：

R1——多糖提取率，%；

c1——提取液中多糖濃度，g/mL；

V——提取液體積，mL；

m——原料質(zhì)量，g。

(2) 多糖得率：按式(2)計算。

(2)

式中：

R2——多糖得率，%；

m1——多糖成品質(zhì)量，g；

m——原料質(zhì)量，g。

(3) 蛋白含量：按式(3)計算。

(3)

式中：

R3——蛋白含量，%；

c2——提取液中蛋白濃度，g/mL；

V——提取液體積，mL；

m——原料質(zhì)量，g。

1.2.6 多糖紫外光譜掃描 將樣品配成1.0 mg/mL的多糖溶液，在波長200～360 nm內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，檢測260，280 nm 處是否有核酸和蛋白質(zhì)的特征吸收峰[13]。

1.2.7 姜渣透射電鏡觀察 收集經(jīng)3種不同方法提取后的姜提取殘渣，凍干，精確稱量10.0 mg凍干粉和100 mL無水乙醇均勻混合。選用300目的高質(zhì)量銅網(wǎng)，用鑷子小心取出銅網(wǎng)，將膜面朝上，并輕放于濾紙上，用移液槍取20 μL待測液滴于銅網(wǎng)上，待其自然風(fēng)干。采用透射電鏡，在100 kV加速電壓，線分辨率0.14 nm條件下觀察細(xì)胞壁破碎情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱水浸提法

2.1.1 熱水浸提法正交試驗因素水平設(shè)計 考察液料比、提取溫度、提取時間對姜多糖提取的影響，根據(jù)單因素試驗結(jié)果，建立三因素三水平正交試驗因素水平，見表1。

表1 熱水浸提法正交試驗因素設(shè)計水平表Table 1 Hot water extraction orthogonal test factor design levelTable

2.1.2 正交試驗結(jié)果及方差分析 熱水浸提法提取姜多糖的正交試驗結(jié)果見表2。通過分析可知，影響姜多糖提取率主次因素依次為B>A>C，最優(yōu)水平組合為A2B3C3，即液料比20∶1 (mL/g)，提取溫度100 ℃，提取時間4 h。由表3可知，液料比、溫度、時間均對姜多糖的提取有顯著性影響(P<0.05)，且溫度具有極顯著性影響(P<0.01)，3個因素影響大小順序與正交試驗結(jié)果相符。在最優(yōu)試驗條件下進(jìn)行3組平行實驗驗證，姜多糖的提取率為(11.74±0.23)%，高于正交試驗中9個試驗組，可見，該正交試驗結(jié)果可靠。

表2熱水浸提法提取姜多糖正交試驗結(jié)果分析

Table 2 Orthogonal experimental results analysis ofZingiberofficinaleRosc polysaccharides extraction with hot water extraction (n=3)

序號ABC提取率/%11115.79±0.0221226.94±0.0831339.44±0.0142127.51±0.0352238.79±0.0262319.55±0.0673137.97±0.0083217.31±0.10933210.28±0.04K122.1721.2722.65K 225.8523.0424.73K 325.5629.2726.20R3.688.003.55

表3 熱水浸提法正交試驗方差分析表?Table 3 Analysis of variance of orthogonal test for hot water extraction

2.2 超聲波冰浴提取法

2.2.1 超聲波冰浴提取法正交試驗因素水平設(shè)計 考察超聲時間、超聲功率和液料比對姜多糖提取的影響，根據(jù)單因素試驗結(jié)果，建立三因素三水平正交試驗因素水平，見表4。

表4超聲波冰浴提取法正交試驗因素設(shè)計水平表

Table 4 Ultrasonic ice bath extraction orthogonal test factor design level
Table

水平A 超聲時間/minB 超聲功率/WC 液料比(mL/g)13040015︰123550020︰134060025︰1

2.2.2 正交試驗結(jié)果及方差分析 超聲波冰浴提取法提取姜多糖的正交試驗結(jié)果見表5。通過分析可知，影響超聲提取姜多糖的工藝順序：C>B>A，且最佳提取工藝條件為A1B2C3，即超聲時間30 min、超聲功率500 W、液料比25∶1 (mL/g)。由表6可知，超聲時間，超聲功率以及液料比均對姜多糖的提取有顯著性影響(P<0.05)，且3個因素影響大小順序與正交試驗結(jié)果相符。對最優(yōu)試驗條件進(jìn)行3組平行實驗驗證，此時姜多糖的提取率為(7.00±0.04)%，高于正交試驗中9個試驗組，表明正交試驗方案設(shè)計穩(wěn)定。

2.3 復(fù)合酶提取法

2.3.1 復(fù)合酶酶解條件正交試驗因素水平設(shè)計 考察液料比、pH值、酶解溫度和酶解時間對姜多糖提取的影響，根據(jù)單因素試驗結(jié)果，建立四因素三水平正交試驗因素水平，見表7。

2.3.2 正交試驗結(jié)果及方差分析 由表8可知，影響復(fù)合酶提取姜多糖的工藝順序為C>B>A>D，且最優(yōu)提取工藝為A1B2C2D3，即液料比25∶1 (mL/g)、酶解時間2.0 h、酶解溫度40 ℃和pH值7.0。由表9可知，溫度、時間、液料比和pH值均對多糖提取率有極顯著性影響(P<0.01)。在最優(yōu)工藝條件下進(jìn)行3組平行實驗進(jìn)行驗證，提取液中姜多糖的提取率為(20.93±0.20)%，結(jié)果遠(yuǎn)高于9個正交試驗組結(jié)果，可見該正交試驗結(jié)果可靠。

2.4 多糖得率、純度及蛋白質(zhì)含量

3種方法提取姜多糖的多糖得率、純度及蛋白質(zhì)含量見表10。由表10可知，復(fù)合酶解法得到的姜多糖得率遠(yuǎn)高于熱水浸提法和超聲波冰浴提取法的；而在純度方面，熱水浸提法相對優(yōu)于超聲波冰浴提取法和復(fù)合酶解法。

2.5 多糖紫外光譜掃描

對3種不同提取方法得到的姜多糖進(jìn)行紫外光譜掃描，如圖1所示，采用Sevag法除蛋白后，姜多糖溶液在260，280 nm 處均未出現(xiàn)明顯的特征吸收峰，從而進(jìn)一步證明sevag法能有效去除姜多糖中的蛋白。

表5超聲波冰浴提取法提取姜多糖正交試驗設(shè)計與結(jié)果分析

Table 5 Ultrasonic ice bath extraction extraction ofZingiberofficinaleRosc polysaccharides orthogonal test design and results analysis (n=3)

序號ABC提取率/%11115.54±0.0521226.36±0.0431336.29±0.0142126.08±0.0552236.57±0.0862315.32±0.0173135.87±0.0083215.46±0.0793325.56±0.01K 118.1917.4916.32K 217.9718.3918.00K 316.8917.1718.73R1.300.902.41

表6 超聲波冰浴提取法正交試驗方差分析表?Table 6 Ultrasonic ice bath extraction orthogonal test analysis of varianceTable

表7復(fù)合酶酶條件正交試驗因素設(shè)計水平表

Table 7 Multi-enzymatic enzyme conditions orthogonal test factor design level
Table

水平A 液料比(mL/g)B pH值C 酶解溫度/℃D 酶解時間/h120︰15.0401.5225︰16.0502.0330︰17.0602.5

2.6 透射電鏡掃描

對比分析不同方法提取多糖剩余姜渣的透射電鏡圖(圖2)可知，結(jié)合姜渣透射電鏡圖，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過熱水浸提后，姜細(xì)胞出現(xiàn)了較明顯的破損，有利于姜多糖溶出；復(fù)合酶解在破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)后，改變了細(xì)胞通透性，使得細(xì)胞中其他水溶性物質(zhì)和多糖一同溶出，從而降低了多糖純度；超聲波提取的原理是利用超聲空化，使多糖更易溶于溶劑，而試驗中利用超聲波提取的姜多糖得率和純度較另2種方法低，其原因主要是采用了冰浴提取法，降低了超聲波對細(xì)胞的破壞，且低溫不利于姜多糖溶出[15]，其他水溶性物質(zhì)，如姜酚等在低溫環(huán)境中溶解度高于多糖[16]，而低溫能減少多糖生物活性損失。

表8復(fù)合酶酶解提取姜多糖正交試驗設(shè)計與結(jié)果分析

Table 8 Orthogonal experimental design and results analysis of extractingZingiberofficinaleRosc polysaccharides by complex enzymatic hydrolysis (n=3)

序號ABC溫度D時間提取率/%1111115.69±0.022122218.80±0.083133318.02±0.124212317.02±0.115223117.71±0.096231215.21±0.037313216.08±0.068321316.84±0.159332116.60±0.01K152.5148.7947.7450.00K249.9453.3552.4250.09K349.5249.8351.8251.88R2.994.564.681.79

表9 復(fù)合酶酶解法正交試驗方差分析表?Table 9 Complex enzymatic method orthogonal test variance analysisTable

表10 多糖得率、純度及蛋白質(zhì)含量Table 10 Polysaccharides yield, purity and protein content (n=3) %

圖1 多糖紫外光譜掃描結(jié)果Figure 1 UV spectral scanning results of polysaccharides

圖2 不同方法提取多糖剩余姜渣透射電鏡掃描結(jié)果圖

Figure 2 TEM scanning results of residualZingiberofficinaleRosc residue extracted by different methods

3 結(jié)論

本試驗利用透射電鏡掃描姜渣，試驗結(jié)果表明，不同提取方法對姜細(xì)胞的破壞有明顯的差異性，從而造成多糖的溶出不同。對比分析3種不同工藝提取的姜多糖，得出復(fù)合酶解法姜多糖得率最高，為(14.67±0.32)%；而在多糖純度方面，熱水浸提法相對另外2種提取方法更好，可達(dá)(86.53±0.20)%。經(jīng)過sevag法除蛋白后，3種姜多糖中蛋白含量均低于0.5%，遠(yuǎn)低于文獻(xiàn)[12]報道。

本試驗中采用超聲波冰浴提取法，姜多糖得率較低，且雜質(zhì)較多。近年來超聲波與酶解法協(xié)同提取法[17]得到廣泛關(guān)注，后續(xù)可利用超聲波-酶解協(xié)同提取姜多糖，同時對比分析2種提取方法在得率、純度以及生物活性等方面的差異。