張曉蒙,李德美,金瑋鋆,宋 濤,張玉紅*,王姍姍,全 莉,閆寅卓,薛 潔

(1.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司,北京 100015;2.酒類品質(zhì)與安全國際聯(lián)合研究中心,北京 100015;3.北京農(nóng)學(xué)院 食品科學(xué)與工程學(xué)院,北京 102206;4.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品開發(fā)與食品科學(xué)研究所,西藏 拉薩 850032;5.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院,新疆 烏魯木齊 830052)

以青稞為原料,通過特有的釀造工藝,利用青稞酒酒曲發(fā)酵釀制而成的青稞酒,口感清香甘甜,醇厚爽口,是西藏地區(qū)迎親送友、聚會慶典必不可少的發(fā)酵飲品[1]。隨著社會的發(fā)展和西南地區(qū)經(jīng)濟轉(zhuǎn)型升級的需要,作為地區(qū)特色,傳統(tǒng)青稞酒的商品化需求日益增大。然而目前,藏地大多青稞酒仍為作坊式生產(chǎn),青稞酒酒體品質(zhì)良莠不齊,制約著青稞酒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

酒曲是中國酒釀造的糖化、發(fā)酵和生香劑,含有多種微生物及其產(chǎn)生的酶,其品質(zhì)對酒的產(chǎn)率和品質(zhì)有極大的影響,故有“曲是酒之骨”之稱[2]。酒曲中微生物的種類及其代謝酶類隨其地域、環(huán)境、曲塊部位和制曲工藝的不同而存在差異[3],目前,對西藏地區(qū)青稞酒酒曲微生物多樣性的研究中,郭小芳等[4]采用傳統(tǒng)微生物研究的方法自西藏6個地區(qū)的9份民間青稞酒酒曲中分離、純化得到67株霉菌;趙東[5]將傳統(tǒng)培養(yǎng)和變性梯度凝膠(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)兩種方法相結(jié)合,對青稞酒酒曲中的真菌、細(xì)菌、有害菌進行了研究,自青稞酒酒曲中分離得到真菌10個屬、共13個種,細(xì)菌9個屬、共22個種,更系統(tǒng)的對西藏青稞酒酒曲微生物多樣性進行了分析。前人雖對西藏地區(qū)的青稞酒酒曲樣品的微生物多樣性進行了分析,但分析釀酒用曲微生物的方法主要為傳統(tǒng)培養(yǎng)方法結(jié)合聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)技術(shù)、非培養(yǎng)方法(變性梯度凝膠電泳(DGGE)、實時熒光PCR技術(shù)和熒光原位雜交技術(shù)(fluorescencein situ hybridization,FISH)等),這些技術(shù)乃能檢測出一定豐度以上的細(xì)菌或特定微生物[6-8],工作量巨大,而且費力、耗時,且結(jié)果可靠性差,并未著重對比分析不同青稞酒酒曲的特點及其差異。而高通量測序技術(shù)可謂是傳統(tǒng)測序技術(shù)的一次革命性改變[9],該測序方法具有通量高、測序周期短以及準(zhǔn)確率高等優(yōu)點[10],可以采集到豐度很低的微生物數(shù)據(jù)。

因此,本研究基于高通量測序技術(shù)對西藏5個地區(qū)共21種青稞酒釀造小曲微生物多樣性進行分析研究,并對比分析各地區(qū)間微生物群落差異,為建立西藏自治區(qū)釀酒微生物菌庫、青稞酒標(biāo)準(zhǔn)化釀造以及優(yōu)良微生物的篩選奠定基礎(chǔ),對分析西藏各地區(qū)青稞酒酒曲微生物差異具有極大地意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

西藏青稞酒酒曲樣品:共21種,均由西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院提供,樣品信息清單見表1。

表1 西藏青稞酒酒曲樣品信息Table1 Informations of Tibet highland barley wine Jiuqu samples

1.1.2 化學(xué)試劑

Fast DNA SPIN Kit for Soil試劑盒(MP)、瓊脂糖:西班牙Biowest Agarose公司;NGS-ITS1 copy1 Barcodel-70、NGS-16s V4 copy1 Barcodel-70:上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;Gold View I核酸染料:北京中生瑞泰科技有限公司;DL2000Marker、AxyPrep脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)凝膠回收試劑盒:美國Axygen公司。

1.2 儀器與設(shè)備

IlluminaMiseq測序儀:美國Illumina公司;BG-Power600電泳儀:北京百晶生物技術(shù)有限公司;Biosystems Model溫度梯度PCR儀:美國伯樂公司;Tanon1600凝膠成像儀:美國伯樂公司;BioSpec-nano核酸蛋白檢測儀:德國Eppendorf公司;2-16N高速微量離心機:湖南恒諾儀器設(shè)備有限公司;Mini-beater組織研磨器:美國Biospec公司。

1.3 方法

1.3.1 青稞酒酒曲總DNA的提取[5,11-12]

菌體分離及總DNA的提取:分別取21種青稞酒酒曲樣品2g于50mL離心管中,記為管1,每個離心管中加入10mL磷酸緩沖鹽溶液(phosphatebuffer saline,PBS),振蕩5 min,形成菌體懸浮液;2 000×g離心5 min,將上清液轉(zhuǎn)移到新的50 mL離心管中,記為管2;向管1中加入10 mL的PBS,振蕩1 min,2 000×g離心5 min,之后再將其中的上清液轉(zhuǎn)移到管2中;重復(fù)步驟向管1中添加PBS,直至轉(zhuǎn)移到管2的上清液變澄清為止;以9 000×g對管2離心10 min,取沉淀,即為青稞酒酒曲中的微生物菌群。

采用Fast DNA SPIN Kit for Soil試劑盒進行DNA的粗提。

1.3.2 PCR擴增[13-14]

取適量的樣品于離心管中,使用無菌水稀釋樣品至1 ng/μL。以稀釋后的基因組脫氧核糖核酸為模板,根據(jù)測序區(qū)域的選擇,對樣品進行ITS的ITS1區(qū)及16SrDNA的V4區(qū)域進行PCR擴增。

PCR反應(yīng)體系:10×PCRbuffer 2.5μL;脫氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate,dNTP)mix 2μL;Taq DNA聚合酶(5 U/μL)0.3μL;DNA模版1μL;上下游引物各1μL;補雙蒸水至50μL。

真菌ITS的ITS1區(qū)域擴增通用引物:ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)、ITS1R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)。

細(xì)菌16SrDNA V4區(qū)域擴增通用引物:515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)、806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。

真菌PCR擴增條件:98℃預(yù)變性3 min;98℃變性45 s,53℃退火30 s,72℃延伸45 s,反應(yīng)35個循環(huán);72℃再延伸8 min,-20℃保存。

細(xì)菌PCR擴增條件:95℃預(yù)變性3 min;95℃變性45 s,50℃退火30 s,72℃延伸45 s,反應(yīng)35個循環(huán);72℃再延伸5 min,-20℃保存。

1.3.3 PCR擴增產(chǎn)物的檢測、純化及混樣

PCR產(chǎn)物使用2%濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測;使用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒對真菌、細(xì)菌的PCR擴增產(chǎn)物進行切膠回收(純化);根據(jù)純化后的PCR產(chǎn)物濃度進行等濃度混樣。

1.3.4 高通量測序[15-17]

采用Illumina Misq高通量測序平臺進行文庫構(gòu)建和上機測序,采用QIIME(V1.7.0)軟件對下機數(shù)據(jù)進行生物信息學(xué)分析,采用R語言繪圖。

1.3.5 主成分分析

根據(jù)高通量測序物種注釋結(jié)果,采用加權(quán)組平均法,計算協(xié)方差矩陣,得到特征值及特征向量,計算主成分載荷因子,得到主成分載荷矩陣,對21個樣品的真菌、細(xì)菌群落進行主成分分析(principal component analysis,PCA)。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理方法

采用Excel 2013、Uparse和SIMCA軟件,對原始數(shù)據(jù)進行處理和圖表編輯。

2 結(jié)果與分析

2.1 西藏不同地區(qū)青稞酒酒曲樣品OTU比較分析

2.1.1 OTU數(shù)目分析

為了研究西藏自治區(qū)5大地區(qū)共21種青稞釀造小曲樣品中物種組成的多樣性,采用Uparse軟件對所有樣品的全部Effective Tags(過濾后得到的拼接序列總數(shù))序列進行聚類分析,以97%的一致性(identity)將序列聚類成操作分類單元(operational taxonomic units,OTUs)。通過比較不同樣品的OTUs數(shù)目,可初步說明樣品中物種的豐富程度。在OTUs構(gòu)建過程中,對不同樣品的Effective Tags、Taxon Tags(用于構(gòu)建OTUs并且獲得分類信息的Tags數(shù)目)、Unclassified Tags(用于構(gòu)建OTUs但沒有獲得分類信息的Tags數(shù)目)、Unique Tags(頻數(shù)為1,并且無法被聚類到OTUs的Tags數(shù)目)、OTUs(最終得到的OTUs數(shù)目)等信息進行初步統(tǒng)計,得到21種不同西藏青稞酒酒曲樣品的真菌、細(xì)菌的Tags和OTUs數(shù)目,結(jié)果見圖1。

由圖1(A)可知,林芝朗縣(XZ1)、昌都江達縣(XZ16)、山南(XZ19、XZ20)和拉薩曲水縣(XZ21)地區(qū)的真菌OTUs值及昌都洛隆縣(XZ9～XZ15)地區(qū)平均OTUs值高于整體樣品平均值,說明真菌種類較為豐富;由圖1(B)可知,日喀則教武場、山南和拉薩曲水縣地區(qū)細(xì)菌OTUs值及林芝、昌都洛隆縣地區(qū)平均OTUs值高于整體樣品平均值,說明細(xì)菌種類較為豐富。由此得出,林芝朗縣地區(qū)、山南地區(qū)、拉薩曲水縣和昌都洛隆縣地區(qū)的青稞酒酒曲微生物種類相對豐富,昌都貢覺縣、昌都城區(qū)和日喀則地區(qū)青稞酒酒曲微生物種類相對較少。

圖1 21種西藏青稞酒酒曲樣品真菌(A)、細(xì)菌(B)的Tags和OTUs數(shù)目統(tǒng)計Fig.1 Statistics of the number of Tags and OTUs of fungi(A)and bacteria(B)in 21 kinds of Tibet highland barley wine Jiuqu

2.1.2 OTU分類分析

按所有樣品間序列的最小值對OTUs聚類結(jié)果進行標(biāo)準(zhǔn)化處理,根據(jù)OTUs聚類分析結(jié)果,分析不同樣品(組)之間的OTUs的共有、特有信息,得到不同樣品(組)之間的OTUs的分類學(xué)信息,并繪制韋恩圖(Venn Graph),結(jié)果見圖2。

圖2 不同樣品組中真菌(A)和細(xì)菌(B)群落的維恩圖Fig.2 Venn graph of fungi(A)and bacteria(B)communities in different sample groups

由圖2(A)可知,林芝、日喀則、昌都、山南和拉薩地區(qū)青稞酒酒曲樣品中真菌的種類依次為109、83、130、140和108種。根據(jù)共有菌種數(shù)目,得到五個地區(qū)真菌共有菌種、特有菌種與總菌種的比例,結(jié)果如表2所不。

表2 西藏不同地區(qū)青稞酒酒曲樣品中共有和特有真菌的占比Table2 Proportion of common and unique fungiin highland barley wine distiller's yeast samples from different Tibet regions

由表2可知,與日喀則、林芝和拉薩地區(qū)比較,山南(22.1%)和昌都(18.5%)地區(qū)特有菌種占比較大。其中,昌都、山南和拉薩曲水縣地區(qū)共有種類為97種,相比其他地區(qū)青稞酒酒曲真菌種類較為接近。

由圖2(B)可知,林芝、日喀則、昌都、山南和拉薩地區(qū)青稞酒酒曲樣品中細(xì)菌的種類依次為967、801、880、817和753種,其細(xì)菌共有菌種、特有菌種與總菌種的比例如表3所不。

表3 西藏不同地區(qū)青稞酒酒曲樣品中共有、特有細(xì)菌的占比Table3 Proportion of common and unique bacteria in highland barley wine Jiuqu samples from different Tibet regions

由表3可知,西藏五個地區(qū)青稞酒酒曲樣品均含有本地特有的細(xì)菌菌種,特有菌種占比介于3.6%～21.9%,其中昌都(15.8%)和林芝地區(qū)(21.9%)青稞酒酒曲細(xì)菌特有菌種的占比更大;除共有菌種、特有菌種外,西藏各地區(qū)青稞酒酒曲樣品之間含有較真菌(最高140種)更多的共有細(xì)菌(最高967種)。其中,山南和拉薩地區(qū)共有種類為691種,相比其他地區(qū)青稞酒酒曲細(xì)菌種類較為接近。

2.2 西藏不同地區(qū)青稞酒酒曲樣品微生物豐度分析

通過高通量測序物種注釋結(jié)果可知,21個青稞酒酒曲樣品中共檢測出真菌140個種、69個屬,屬于4個菌門,分別為子囊菌門(Ascomycota)、接合菌門(Zygomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota);檢測出細(xì)菌967個種、309個屬,屬于9個菌門,分別為厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)、綠彎菌門(Chloroflexi)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、浮霉菌門(Planctomycetes),且還包括一個古生菌門,奇古菌門(Thaumarchaeota)。以物種的豐度＞1%作為劃分依據(jù),選取在屬分類水平上相對豐度前10名的真菌、細(xì)菌菌屬進行分析,以相對豐度為縱坐標(biāo),樣品名為橫坐標(biāo),繪制物種相對豐度柱形圖,結(jié)果如圖3所不。

圖3 真菌(A)和細(xì)菌(B)群落屬水平的相對豐度Fig.3 Relative abundance of fungi(A)and bacteria(B)at genus levels

由圖3(A)可知,西藏五個地區(qū)青稞酒酒曲樣品的共有優(yōu)勢真菌菌屬為覆膜孢酵母屬(Saccharomycopsis)、根霉屬(Rhizopus)和毛霉屬(Mucor)。其中,林芝和山南地區(qū)青稞酒酒曲樣品中根霉屬(Rhizopus)占比較大,平均占比分別為66%和73%。根霉屬(Rhizopus)、毛霉屬(Mucor)和曲霉屬(Aspergillus)的主要作用是代謝產(chǎn)生淀粉酶和蛋白酶,將淀粉、蛋白質(zhì)降解為還原糖、氨基酸等小分子物質(zhì),供酵母生長,并兼具一定的發(fā)酵力[18-19]。日喀則、昌都和拉薩曲水縣地區(qū)青稞酒酒曲樣品中覆膜孢酵母屬(Saccharomycopsis)占比較大,平均占比分別為78%、89%和85%。覆膜孢酵母屬(Saccharomycopsis)屬非釀酒酵母,包括伊薩酵母屬(Issatchenkia)和蘭久浩酵母屬(Guehomyces)等,均對青稞酒的風(fēng)味具有重要作用。

除此之外,山南地區(qū)青稞酒酒曲樣品中的伊薩酵母屬(Issatchenkia)和假絲酵母屬(Candida)平均占比分別為其他地區(qū)的9倍和22倍。包怡紅等[20]研究證明伊薩酵母屬(Issatchenkia)能較好的代謝產(chǎn)生胞外多糖,抗氧化能力突出;杜木英等[21]指出假絲酵母屬(Candida)可產(chǎn)生淀粉糖化酶而水解淀粉,且發(fā)酵產(chǎn)物對青稞酒的風(fēng)味產(chǎn)生重要影響。山南和拉薩曲水縣地區(qū)的異常威克漢姆酵母屬(Wickerhamomyces)的平均占比分別為其他地區(qū)的19倍和25倍。且在拉薩曲水縣地區(qū)檢出特有真菌菌屬蘭久浩酵母屬(Guehomyces)。宋春麗[22]在南極海洋泥樣品中分離鑒定出一株隸屬蘭久浩酵母屬(Guehomyces)的真菌,并驗證了其高產(chǎn)乳糖酶性及耐冷性。

此外,林芝朗縣、日喀則藏式街、昌都洛隆縣和昌都城區(qū)的曲霉屬(Aspergillus)為優(yōu)勢菌屬,占比均在0.15%以上,為其他地區(qū)的8倍以上。昌都地區(qū)特有真菌菌屬為籃狀菌屬(Talaromyces)。林芝朗縣和山南地區(qū)檢出了含量很低的青霉屬(Penicillium),青霉屬(Penicillium)的某些種可代謝產(chǎn)生赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)[23],為酒曲中的有害菌。故應(yīng)著重注意發(fā)酵工藝及條件,避免該菌種代謝產(chǎn)生毒素。

由圖3(B)可知,西藏五個地區(qū)青稞酒酒曲樣品的共有優(yōu)勢細(xì)菌菌屬為乳酸桿菌屬(Lactobacillus)和明串珠菌屬(Leuconostoc)。其中,乳酸桿菌屬(Lactobacillus)在昌都各地區(qū)的相對豐度值的平均占比在90%以上;林芝和日喀則地區(qū)次之,平均占比約為50%左右;山南和拉薩曲水縣最少,平均占比在20%以下。明串珠菌屬(Leuconostoc)在林芝和日喀則地區(qū)相對豐度值較大,占比平均值約為30%。此外,林芝、日喀則、昌都洛隆縣和昌都城區(qū)的片球菌屬(Pediococcus)平均占比均為其他地區(qū)的4倍以上,其中日喀則為16倍。昌都洛隆縣、昌都城區(qū)、山南和拉薩曲水縣的魏斯氏菌屬(Weissella)平均占比為其他地區(qū)的35倍以上,其中昌都城區(qū)最高,為170倍。林芝朗縣和日喀則城區(qū)優(yōu)勢菌屬有乳球菌屬(Lactococcus),在日喀則城區(qū)樣品中占比較大,約為10%。上述所提菌屬均為乳酸菌,可在發(fā)酵初期制造酸性環(huán)境,產(chǎn)生胞外多糖,并代謝產(chǎn)生乳酸和乙酸[24-26],在直接影響酒類風(fēng)味的同時,還可與乙醇作用產(chǎn)生乳酸乙酯、乙酸乙酯等酯類物質(zhì),賦予青稞酒飽滿的香氣[27];除了對風(fēng)味的影響,乳酸菌可通過產(chǎn)生有機酸、競爭營養(yǎng)成分、產(chǎn)生乳酸菌素等途徑抑制食源性致病菌[28-31]。此外,有文獻報道[5],部分乳酸菌對釀酒過程是不利的,也需要對這些不利于釀酒發(fā)酵的群落加以控制和篩選。故應(yīng)辯證的研究青稞酒酒曲中的乳酸菌,加以控制及改良。

山南和拉薩曲水縣優(yōu)勢菌屬有慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)和不動桿菌屬(Acinetobacter),其中,慢生根瘤菌屬占比為65%以上。昌都貢覺縣、昌都城區(qū)、山南和拉薩曲水縣的芽孢桿菌屬(Bacillus)平均占比較高,其中昌都貢覺縣占比為2.2%,幾乎為其他地區(qū)的100倍。在昌都洛隆縣檢出了含量很低的假單胞菌屬(Pseudomonas)。芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)和慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)等,可通過調(diào)節(jié)根圍土壤中生物群落,活化土壤養(yǎng)分、改善理化特性、促進作物生長發(fā)育、增加作物產(chǎn)量和改善品質(zhì)[32]。朱丹[33]通過對青稞土壤施用微生物有機肥,改善土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性,從而證明芽孢桿菌屬(Bacillus)、慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)等對土壤的固氮作用。有資料表明,酵母菌的氮代謝對酒的風(fēng)味品質(zhì)有重要影響[34],且芽孢桿菌屬的某些種是生成酒體芳香類物質(zhì)的菌源[35]。由此得出,從細(xì)菌角度,在釀制風(fēng)味品質(zhì)較高的青稞酒產(chǎn)品方面,山南和拉薩曲水縣地區(qū)的青稞酒酒曲比較有優(yōu)勢。

2.3 西藏不同地區(qū)青稞酒酒曲樣品微生物群落主成分分析

將西藏五大地區(qū)青稞酒酒曲樣品的真菌、細(xì)菌群落信息整合,采用SIMCA軟件,對西藏五大地區(qū)青稞酒酒曲樣品的微生物群落進行主成分分析,結(jié)果如圖4所不。

圖4 不同青稞酒酒曲樣品微生物群落的主成分分析Fig.4 Principal component analysis of microbial communities in different highland barley wine Jiuqu samples

由圖4可知,當(dāng)PC1為53.2%,PC2為36.7%時,林芝與日喀則地區(qū)、昌都地區(qū)、山南地區(qū)、拉薩地區(qū)分別獨立呈現(xiàn)于主成分分析圖上,有著清晰地界限(P＜0.05)。其中,山南地區(qū)樣品與其他地區(qū)距離最遠(yuǎn),差異性最為顯著(P＜0.01);林芝米林縣與日喀則各地區(qū)樣品微生物群落距離較為接近,差異性不明顯(P＞0.05)。在各地區(qū)內(nèi)部樣品間也存在一定差異:林芝朗縣樣品與林芝米林縣樣品距離較遠(yuǎn),存在一定差異(P＜0.05);昌都江達縣、貢覺縣、洛隆縣樣品之間微生物群落信息無明顯差異(P＞0.05),而昌都城區(qū)則與昌都其他村縣樣品呈現(xiàn)一定的差異性(P＜0.05)。

3 結(jié)論

本研究對西藏自治區(qū)林芝、日喀則、昌都、山南和拉薩五個地區(qū)共計21個青稞酒釀造小曲樣品中的微生物多樣性進行了分析。結(jié)果表明,西藏五個地區(qū)的青稞酒酒曲樣品中共有菌種較多,但不同地區(qū)均擁有一定比例的特有菌種,各地區(qū)間的共有菌種數(shù)目不同;昌都、山南、拉薩曲水縣和林芝地區(qū)青稞酒酒曲微生物種類相對豐富,日喀則地區(qū)青稞酒酒曲微生物種類相對較少;群落維恩圖和微生物豐度屬水平分析表明,西藏五個地區(qū)青稞酒酒曲樣品的共有優(yōu)勢真菌菌屬為覆膜孢酵母屬(Saccharomycopsis)、根霉屬(Rhizopus)和毛霉屬(Mucor),優(yōu)勢細(xì)菌菌屬為乳酸桿菌屬(Lactobacillus)和明串珠菌屬(Leuconostoc)。主成分分析說明,各地區(qū)青稞酒酒曲樣品微生物差異性顯著且各地區(qū)不同村縣的青稞酒酒曲樣品也存在一定差異(P＜0.05)。