陳旭青，陳醒，吳蘇亞，駱雨璇，王楠

(南京軍區(qū)南京總醫(yī)院藥品科，江蘇 南京 210002)

中藥丹參是唇形科鼠尾草屬植物丹參(SalviamiltiorrhizaBunge)的干燥根及根莖，丹參味微苦，性微寒，中醫(yī)臨床上常用于活血調(diào)經(jīng)，除煩安神[1]。前期研究中表明丹參中主要的有效成分為水溶性丹酚酸類和脂溶性丹參酮類成分[2]，丹酚酸類化學(xué)成分具有抗氧化、抗凝血及保肝護(hù)肝等作用，丹參酮類具有抗血栓、抗過敏等作用。目前，中醫(yī)藥臨床上關(guān)于丹參植物資源的利用仍以其干燥根及根莖為主，每年產(chǎn)量5 000～7 000噸。在丹參藥材采收加工及制藥過程中，約占全株重量67%的非藥用部位(葉、莖、花)尚未被有效利用而被作為廢棄物丟棄，造成資源浪費(fèi)和環(huán)境污染[3]。清代《醫(yī)方守約》中對(duì)丹參葉就有記載：“丹參葉搗爛，合酒糟敷乳，腫初起立消”。近年來多項(xiàng)研究報(bào)道丹參莖和葉具有抗菌、抗病毒等多種生物活性，可用于血栓、冠心病等心腦血管疾病[4-5]。丹參花可配制成丹參花露飲品，具有擴(kuò)張血管、預(yù)防心血管疾病的保健功效[6]?；瘜W(xué)成分分析結(jié)果表明，丹參地上部分富含丹參酚酸類、黃酮類等化學(xué)成分[7-8]。本研究通過對(duì)丹參(葉、莖、花、根)中丹酚酸類、黃酮類化學(xué)成分進(jìn)行分析評(píng)價(jià)，擬為丹參地上部分資源價(jià)值的開發(fā)利用，丹參藥用資源利用效率的提升以及尋找和擴(kuò)大丹參新藥源提供科學(xué)的依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1儀器Waters ACQUITY UPLC 系統(tǒng)(二元高壓泵，自動(dòng)進(jìn)樣器，柱溫箱，二極管陣列檢測器，Waters 公司) ；Waters超高效液相(UPLC)色譜系統(tǒng)、Waters PAD檢測器。FW80型高速萬能粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)，ML204/02、MS205 電子天平(上海梅特勒托利多儀器有限公司)，DHG-9023A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；KH-500 型超聲波清洗儀器 (昆山禾創(chuàng)聲波儀器有限公司)；EPED 超純水系統(tǒng)(南京易普達(dá)易科技發(fā)展有限公司)；Anke GL-16GII 型離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.2試藥與試劑丹參樣品采自南京中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物園，經(jīng)南京軍區(qū)南京總醫(yī)院藥品科主任鑒定為唇形科鼠尾草屬植物丹參(SalviamiltiorrhizaBunge)。樣品分別于熱風(fēng)烘干(50 ℃)條件下進(jìn)行干燥，至恒重后粉碎，將其常溫密封干燥保存?zhèn)溆谩?/p>

對(duì)照品丹參素(批號(hào)MUST-13030108)、咖啡酸 (批號(hào) 110885-200102)、蘆丁(批號(hào)100080-201409)、迷迭香酸(批號(hào)1871-20103)均購自中國食品藥品檢定研究院；丹酚酸B(批號(hào)MUST-13030203)、異槲皮苷(批號(hào)MUST-15070211)、丹酚酸 A(批號(hào) MUST-13030701)均購自北京普天同創(chuàng)生物科技有限公司，純度均大于 98%。乙腈(色譜純，美國 Tedia公司)，甲酸(色譜純，德國Merck)，甲醇、無水乙醇購自南京化學(xué)試劑有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1對(duì)照品溶液的制備取干燥至恒重的對(duì)照品適量，精密稱定，以甲醇溶解，置于10 mL量瓶中，定容至刻度，搖勻，配成丹參素、咖啡酸、蘆丁、異槲皮苷、迷迭香酸、丹酚酸 B、丹酚酸 A濃度分別為 0.108、0.106、0.354、0.305、0.137、0.211、0.106 g·L-1的混合對(duì)照品溶液。

2.2供試品溶液的制備稱取丹參地上樣品(葉、莖和花)和丹參根干燥粉末各0.5 g，精密稱定，置于100 mL具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇20 mL后進(jìn)行稱重，靜置4 h后于80 ℃回流1.5 h后補(bǔ)足減失的重量，濾過，濾液在3 000 r·min-1下離心10 min，取上清液過0.45 mm的濾膜后進(jìn)樣。

2.3色譜條件Waters ACQUITYUPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)色譜柱；柱溫：35℃；流動(dòng)相：乙腈(A) -0.1%甲酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～2 min，5%～15% A；2～3 min，15%～15% A；3～6 min，15%～25%A；6～7 min，25%～40% A；7～9 min，40%～80% A；9～10 min，80%～80%A；10～11 min，80%～100% A)；流速：0.4 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL；檢測波長：酚酸類成分為280 nm，黃酮類為254 nm。對(duì)照品和丹參各部位UPLC色譜圖見圖1。

2.4線性范圍考察精密量取“2.1”項(xiàng)下丹參素、咖啡酸、蘆丁、異槲皮苷、迷迭香酸、丹酚酸 B、丹酚酸 A對(duì)照品儲(chǔ)備液，稀釋，配成不同濃度的混合對(duì)照品溶液，按照“2.3”項(xiàng)下方法分別進(jìn)行測定，記錄各峰面積，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表1。

注：1為丹參素；2為咖啡酸；3為蘆丁；4為異槲皮苷；5為迷迭香酸；6為丹酚酸B；7為丹酚酸A圖1 混合對(duì)照品(A)、葉(B)、莖(C)、花(D)、根(E) UPLC色譜圖

化合物成分回歸方程R2線性范圍/mg·L-1丹參素Y=3317.6X-99.3330.999 50.54～108咖啡酸Y=15365X-1181.10.999 70.53～106蘆丁Y=9608.1X+8857.70.999 93.54～354異槲皮苷Y=13389X-5665.40.999 73.05～305迷迭香酸Y=8292.8X+85.7290.999 80.69～137丹酚酸BY=5042.3X-734.90.999 81.06～211丹酚酸AY=11106X-5220.40.999 60.53～106

2.5精密度試驗(yàn)精密吸取“2.1”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液10 μL，按照“2.3”項(xiàng)下方法連續(xù)進(jìn)樣6次，測定丹參素、咖啡酸、蘆丁、異槲皮苷、迷迭香酸、丹酚酸 B、丹酚酸 A色譜峰峰面積，計(jì)算各峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，考察儀器的精密度，分別為0.93%、1.44%、0.53%、1.97%、1.91%、1.11%、1.96%，結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)方法精密度良好。

2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一批對(duì)照品溶液，按照“2.3”項(xiàng)下條件，分別在0、4、8、12、18、24 h進(jìn)行測定，記錄峰面積值，計(jì)算各物質(zhì)的RSD，最終丹參素、咖啡酸、蘆丁、異槲皮苷、迷迭香酸、丹酚酸 B、丹酚酸 A的RSD分別為1.54%、1.32%、1.09%、2.76%、1.52%、1.42%、2.24%，結(jié)果表明樣品溶液在24 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

2.7重復(fù)性試驗(yàn)按照 “2.2”項(xiàng)下方法制備6份干燥根樣品溶液，按“2.3”項(xiàng)下條件測定丹參素、咖啡酸、蘆丁、異槲皮苷、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A的峰面積，計(jì)算各物質(zhì)量的RSD分別為2.46%、0.36%、1.93%、1.79%、2.36%、3.30%、0.76%，表明樣品重復(fù)性良好。

2.8加樣回收率試驗(yàn)精密稱定已知濃度的干燥根樣品3份，分別按已知濃度的80%、100%、120%加入丹參素、咖啡酸、蘆丁、異槲皮苷、迷迭香酸、丹酚酸 B、丹酚酸 A的對(duì)照品，混勻，按照“2.2”項(xiàng)方法進(jìn)行處理，在“2.3”項(xiàng)色譜條件下測定，記錄峰面積，計(jì)算加樣回收率及RSD，最終結(jié)果回收率分別為96.24%、102.47%、101.06%、97.17%、97.23%、98.28%、98.33%，RSD 分別為2.68%、1.60%、2.09%、2.92%、1.68%、1.14%、3.23%。

2.9樣品分析評(píng)價(jià)精密吸取樣品溶液10 μL，注入超高效液相色譜儀，記錄其峰面積，計(jì)算樣品中丹參素、咖啡酸、蘆丁、異槲皮苷、迷迭香酸、丹酚酸 B、丹酚酸 A的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表2。

表2 丹參不同部位中酚酸類及黃酮類成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)比較分析

注：“—”表示未檢測到此成分

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，丹參地上部分(葉、莖和花)與丹參根相比較，均含有豐富的水溶性丹酚酸類成分，主要為丹參素、咖啡酸、迷迭香酸和丹酚酸B。丹參根中丹參素和丹酚酸B含量高于丹參地上部分，而丹參地上部分中咖啡酸和迷迭香酸含量高于丹參根。此外與丹參根相比，丹參地上部分富含黃酮類成分，主要為蘆丁和異槲皮苷，提示可將丹參地上部分作為獲取丹酚酸類及黃酮類化學(xué)成分的新資源。

丹參中富含以丹參酮A為代表的脂溶性成分和以丹酚酸B為代表的水溶性成分，是臨床常用活血化瘀中藥之一。兩類成分研究均已較為深入且已研發(fā)復(fù)方丹參滴丸、丹參片等中藥制劑，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于冠心病、心絞痛的預(yù)防和治療。隨著復(fù)方丹參滴丸等藥品進(jìn)入國際市場，臨床需求量大幅上升，對(duì)丹參植物資源的需求也日益增加，而丹參入藥以其干燥根及根莖為主，因此大量的丹參非藥用部位(葉、莖、花)常作為廢棄物被丟棄，造成資源浪費(fèi)和環(huán)境污染[9-10]。隨著中藥非藥用部位的資源價(jià)值越來越被重視，人們對(duì)中藥非藥用部位化學(xué)成分的研究也越來越深入[11-13]。丹參莖葉富含酚酸類成分，因此丹參莖葉可作為提取丹參酚酸類成分的優(yōu)良輔料，曾有專利報(bào)道以丹參莖葉為原料，經(jīng)水提、冷藏及離心過濾、調(diào)pH值、大孔吸附樹脂分離、干燥等工藝制備得到資源性成分丹參素及丹酚酸B，充分利用了丹參莖葉資源[14]。丹酚酸類資源性物質(zhì)具有較為廣泛的生理活性，如抗氧化、抗血小板聚集、抗血栓、防止動(dòng)脈硬化等作用[11]。

本研究分析比較了丹參不同部位中酚酸類、黃酮類資源性化學(xué)成分，為開發(fā)利用新藥源，提高中藥資源利用效率，實(shí)現(xiàn)資源節(jié)約和生態(tài)保護(hù)提供依據(jù)，對(duì)推動(dòng)丹參資源植物的綜合循環(huán)利用具有重要的經(jīng)濟(jì)—社會(huì)—生態(tài)效益。