皮慶猛 王曉磊 張志亮 周碧玉 任曉蕓 陸毅 黃一雄 傅敏剛 范志宏

生物打印技術的出現(xiàn)，為快速精準構建有生物活性的組織或器官提供了可能[1]。由于空腔組織或器官的特殊性，在體外快速生物打印過程中，依然面臨著巨大挑戰(zhàn)[2]。本實驗前期工作已經(jīng)證實，依靠同軸共軛打印系統(tǒng)，利用明膠衍生物和海藻酸鹽分別具有光交聯(lián)和離子交聯(lián)的特性，可以快速構建單層的空腔組織[3-5]。為了進一步構建含有復層亞結構的空腔組織，我們改進打印噴頭，借助快速離子交聯(lián)和光交聯(lián)固化水凝膠的方法，探討同時打印復層亞結構的尿道組織的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料試劑

豬源明膠（Gelatine，type-A，300 bloom）、甲基丙烯酸酐（Methacrylic Anhydride，MW＝154.16）、海藻酸鹽 （Sodium alginate，MW＝33 KDa，low viscosity）、氯化鈣、EDTA等購自Sigma公司。胎牛血清、PBS、HEPES緩沖液、0.25%胰酶、高糖基礎培養(yǎng)液DMEM等購自Gibico公司。細胞活力檢測（live/dead）試劑盒、細胞增殖能力檢測試劑盒（prestoblue）、細胞骨架蛋白 F-actin（Alexa-594、Alexa-488）、細胞核染料DAPI等購自Life Technologies公司。尿道上皮細胞株和尿道平滑肌細胞株購自Scien Cell公司。

Instron 生物力學檢測儀 （Model 5542，USA），RHEOPLUS-32 流變儀 （Anton Paar，Germany），3D生物打印機 NovoGen MMX bioprinter（Organovo，USA），多通道打印噴頭由本實驗室自行組裝。

1.2 實驗方法

1.2.1 復合水凝膠制備及復層打印系統(tǒng)改進

①本實驗復合水凝膠借鑒Ali Khademmhosseni的方法[4-6]，將7% GelMA與2% Alginate混合制備成復合水凝膠。②同軸共軛復層打印噴頭改裝參照文獻[4]，改進不同亞層的復合打印。③利用同軸共軛復層打印系統(tǒng)，分別將復合水凝膠與細胞復合后，同時打印管腔組織結構的內(nèi)外亞層。

1.2.2 復層空腔結構打印

①參照文獻[4]，將7% GelMA和2% Alginate制備成復合水凝膠，每管3 mL，共2份，37℃培育箱孵育備用。②將復合水凝膠分別與綠色和紅色microbeads顏料混合，轉移至3 mL注射器內(nèi)，震動混勻。③將注射器連接打印機，軟管通過27 G針頭固定，以勻速（10～20 μL/min）助推泵推送水凝膠。④以80～200 μL/min 推送 Ca2+，邊打印邊交聯(lián)，將空腔管打印在含有CaCl2的培養(yǎng)皿內(nèi)。⑤打印后，快速將空腔組織轉移至 UV燈下，360～480 nm、6.9 mW/cm2紫外交聯(lián)30 sec。⑥倒置熒光顯微鏡下拍照觀察空腔管腔結構并測量不同亞層結構的管徑、管壁大小。

1.2.3 復層尿道管腔組織打印

①復合水凝膠準備如上述。②取狀態(tài)良好的人尿道上皮細胞（EC）和人尿道平滑肌細胞（SMC），調(diào)整細胞數(shù)量為2×106cells/mL，消化離心后，去上清，保留細胞團塊，各與1 mL復合水凝膠輕輕混勻，轉移至1 mL注射器內(nèi)，置孵育箱備用。③將含有細胞水凝膠復合物的注射器連接軟管，分別連接打印噴頭并固定于打印機器NovoGen MMX bioprinter助推泵上。④注射器吸取3 mL無菌3% CaCl2后，連接打印噴頭并固定。⑤通過調(diào)節(jié)打印噴頭行進速度及不同通道間的推進流速，以打印出穩(wěn)定空心管結構。⑥將打印出含有細胞的空腔組織轉移至六孔板內(nèi)，予以尿道上皮細胞和尿道平滑肌細胞混合培養(yǎng)液體外培養(yǎng)。⑦自打印當天（打印后30 min）至第7天，live/dead染色檢測細胞活力及增殖情況。⑧F-actin免疫組化染色檢測鋪展情況：4%多聚甲醛固定1 h，0.1% TritonX100處理半小時，1% BSA封閉 2 h，Alex488 F-actin抗體4℃孵育過夜，次日PBS洗2遍，1∶1 000加入DAPI，反應5～10 min。⑨分別將樣本固定后，于倒置熒光顯微鏡下觀察，不同視野隨機取3個區(qū)域拍照。

1.2.4 復層尿道組織灌注

①復層尿道組織打印方法同前。②將打印后復層管狀組織用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液體外培養(yǎng)24 h。③用27 G針頭固定打印復層管一端，用含有紅色顏料的灌注液持續(xù)灌注復層管狀組織。④視頻記錄灌注情況。

2 結果

2.1 具有雙亞層結構尿道空腔組織打印設想

為同時構建具有內(nèi)層尿道上皮和外層尿道平滑肌復層結構的尿道組織，我們設想在打印系統(tǒng)中，能夠獨立、快速地同時分開打印不同亞層結構。在實驗室前期工作基礎上[4]，改進一種同軸多通道生物打印系統(tǒng)（圖1）。分別將尿道上皮細胞（內(nèi)層）和尿道平滑肌細胞（外層）與含有7% GelMA和2% Alginate的復合水凝膠混合，在快速打印過程中，利用Ca2+可以快速交聯(lián)海藻酸鹽的特性，由計算機輔助控制系統(tǒng)內(nèi)外雙層結構分別在不同的通道勻速泵出，實現(xiàn)邊打印邊固化（圖1A）；然后將凝膠化的復層管腔結構，再利用紫外線交聯(lián)固化水凝膠中的GelMA，實現(xiàn)進一步固化。這個快速打印過程中，不同亞層結構的同時分開打印是關鍵，為實現(xiàn)不同亞層在一個同軸層面，我們改進了打印噴頭（圖1B）。利用計算機輔助控制打印噴頭、動力泵勻速助推的不同通道的細胞水凝膠復合物，來實現(xiàn)同時快速打印不同亞層的目的。

2.2 復層尿道管腔組織打印

為了驗證我們的新打印系統(tǒng)，便于觀察打印后不同亞層間的差異，我們將空腔管狀結構的內(nèi)、外層水凝膠分別與綠色和紅色顏料混合，利用同軸多通道打印系統(tǒng)打印出空腔結構（圖2）。通過顏料的差異標識，我們可以清楚看到內(nèi)、外管同時打印后的綠色和紅色顏料復合的橙黃色結構，以及僅單層時的綠色結構（圖2B）。復層管腔結構橫斷面、縱切面可清楚看到紅色顏料位于復層管腔結構的外層，而綠色顏料均勻分布于復層管腔的內(nèi)層（圖2C-D），特別是兩層結構內(nèi)的顏料不相互滲入，并可分離（圖2D）。通過檢測，復層管腔的內(nèi)、外徑分別為（663.66±51.74）μm和 （976.84±63.43） μm， 內(nèi)、 外亞層壁厚分別為（93.78±10.25） μm 和（62.06±10.45） μm。

圖1 復層空腔結構打印設計Fig.1 Schematic of multiple-layers structure

圖3 尿道細胞復合水凝膠打印后細胞活力觀察Fig.3 Cell viability observation of hollow tissue bioprinted with loading urethral cells

2.3 復層尿道組織長期體外培養(yǎng)

為了實現(xiàn)尿道空腔組織的生物打印構建，我們將尿道細胞（上皮細胞和平滑肌細胞）分別跟復合水凝膠（7% GelMA和2% Alginate）混合，通過同軸多通道打印系統(tǒng)快速打印?？涨唤M織打印后30 min左右的細胞活力在84.52%以上（圖3A），培養(yǎng)7 d后空腔結構中的尿道細胞仍可以存活，并能維持細胞活力在86.26%以上（圖3B）。培養(yǎng)7 d后，將組織固定染色，我們可以看到細胞在空腔結構內(nèi)可以充分鋪展開（圖3C）。這說明尿道細胞經(jīng)過同軸多通道打印系統(tǒng)打印后，細胞可以在空腔結構內(nèi)長期存活，并能夠鋪展。

2.4 復層尿道管腔組織灌注

為進一步明確打印后組織是否是真正貫通的空腔三維結構，我們將打印的空腔組織體外培養(yǎng)24 h后，兩端通過軟管跟動力泵連接并固定（圖4A），可見含有顏料的灌注液可通過空腔組織（圖4B），說明打印后組織具有良好的灌注性。

圖2 復層空腔結構打印Fig.2 Multiple-layers printing of hollow structure

圖4 空腔結構灌注Fig.4 Perfusion of hollow structure

3 討論

空腔組織的生物打印面臨著巨大挑戰(zhàn)[5，7]。實體組織生物打印，一般可通過計算機輔助控制實現(xiàn)不同層次的快速疊加來實現(xiàn)[8-10]。但是，空腔組織的三維結構如何維持是打印過程中面臨的一個難題。理論上講，水凝膠固化后力學性能足夠，實體組織打印可構建很多層次。本實驗通過復合GelMA和海藻酸鹽Alginate，增加了打印過程中水凝膠固化后力學強度（力學測試數(shù)據(jù)未出示），從而實現(xiàn)打印后空腔組織三維結構的維持。通過不同亞層的區(qū)分打印，將復雜空腔組織的不同亞層組織細胞區(qū)分構建以實現(xiàn)不同亞層的功能。為了區(qū)分不同亞層，我們先將不同顏色的microbeads與復合水凝膠混合，以達到區(qū)分不同亞層的目的，實驗證實不同亞層可以同時區(qū)分打印。通過測量，亞層的結構厚度分別為內(nèi)層（62.06±10.45） μm 及外層（93.78±10.25） μm，約為1～2個細胞的厚度。通過打印噴頭的設計調(diào)整，可以實現(xiàn)厚度的變化（數(shù)據(jù)未出示）。

將尿道細胞分別與復合水凝膠混合后打印，實驗證實細胞可以長期存活，體外培養(yǎng)后細胞活力在80%以上。但是，在體外培養(yǎng)早期細胞活力有一個明顯的下降過程，至第3天細胞活力在30%左右。這可能跟打印過程中的操作對細胞造成損傷有關，該現(xiàn)象跟文獻報道基本一致[11-13]。實驗發(fā)現(xiàn)，打印后空腔組織在體外培養(yǎng)7 d，尿道細胞可以鋪展開，說明細胞在復合水凝膠空腔支架內(nèi)可以生長。而打印后24 h內(nèi)的灌注實驗表明，打印空腔組織具有貫通的三維結構。上述結果表明，雖然打印過程中由于剪切力、管道擠壓等對細胞造成損傷，但長期培養(yǎng)細胞是能夠成活的。這進一步說明，利用該方法最終構建出具有生物學功能的尿道組織是可行的。但是，實驗中我們也發(fā)現(xiàn)，打印后組織結構在培養(yǎng)液內(nèi)長期靜態(tài)培養(yǎng)后，管壁結構非常脆弱，我們嘗試對培養(yǎng)時間較久的結構進行灌注，結果并不理想。今后通過增加打印后組織培養(yǎng)過程中的力學強度或進行動態(tài)培養(yǎng)，也許能解決這個難題，有待于進一步的實驗研究。

綜上所述，本實驗將尿道上皮細胞和尿道平滑肌細胞分別同復合水凝膠 （7% GelMA和2% Alginate）混合，通過改裝同軸多通道生物打印系統(tǒng)快速構建具有空腔復層結構的組織，實驗初步證實尿道細胞在打印后組織中可以長期存活，并有灌注功能。