任超 黃茜 王萍 李瑩 楊兆祥 張建文

650100昆明,昆藥集團(tuán)股份有限公司

單純皰疹病毒(herpes simplex virus，HSV)是一種雙鏈DNA包膜病毒，根據(jù)血清型不同可分為Ⅰ型和Ⅱ型(HSV-1和HSV-2)。世界衛(wèi)生組織(WHO)報道，全球約90%的人口感染過皰疹病毒，最常見的是HSV-1，可以潛伏感染，亦可被激活引起皮膚皰疹或生殖器皰疹、結(jié)膜炎、角膜炎、腦炎或皰疹性濕疹等[1]。

目前沒有可用于防治HSV感染的疫苗，臨床常用的治療藥物是以阿昔洛韋(acyclovir，ACV)為代表的核苷類似物。但是，大多數(shù)核苷類藥物都有靶點(diǎn)單一、生物利用度低、半衰期短和副作用嚴(yán)重的缺陷，且長期使用會產(chǎn)生耐藥[2]。因此，尋找新作用機(jī)理、毒副性小的抗HSV藥物有實(shí)際臨床需求。隨著對天然產(chǎn)物藥物研究的不斷深入，大量天然產(chǎn)物單體、活性部位或復(fù)方被報道具有抗HSV方面的藥理作用，如夏枯草多糖、黃芪總皂苷、青蒿縮合鞣質(zhì)(CTA)、藍(lán)花荊芥提取物等[3]。肉桂(Cinnamomum cassia)是我國常用中藥材。本研究以Vero細(xì)胞和HSV-1(角膜)感染動物模型研究了肉桂水提物KPC-rg1對HSV-1的抗病毒作用；進(jìn)一步的，通過體外抗病毒活性實(shí)驗(yàn)探索了KPC-rg1對9種病毒的潛在廣譜抗病毒作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒:本研究測試的病毒見表1。

1.1.2 細(xì)胞株:Hep-2(ATCC CCL-23)，RD(Cell bank of CAS-TCHU 45)，Vero E6(ATCC CRL-1586)，Vero(中科院昆明動物所)，H1 HeLa(ATCC CRL-1958)， MRC5(ATCC CCL-171)，MT-4(NIH AIDS項(xiàng)目)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動物:雌性BALB/c小鼠與雌性6月齡樹鼩，購自昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.1.4 藥材與藥物:肉桂購自昆明市官渡區(qū)滇芝堂，經(jīng)鑒定為樟科植物肉桂(Cinnamomum cassia Presl)的干燥樹皮。阿昔洛韋(批號:20160811，純度:99.82%，湖北科益藥業(yè)股份有限公司)。

1.1.5 試劑與儀器:CCK8試劑盒(天津百螢)；CellTiter-Glo試劑盒(Promega)；小牛血清(GIBCO)；DMEM(Thermo Scientific)；SpectraMax340PC384 型酶標(biāo)儀(Molecular Device)；UB-7型pH(丹佛儀器有限公司)；Synergy/HT(BioTek)；Acumen eX3 高內(nèi)涵成像儀(TTP Labtech)；天平(METTLER TOLEDO MS)；離心機(jī)(Sorvall biofuge stratos)；XD—202型光學(xué)顯微鏡(江南光學(xué)儀器廠)；CO2培養(yǎng)箱(Thermo)。

1.2 方法

1.2.1 肉桂水提物KPC-rg1的制備:取肉桂樹皮粉碎，過24目篩，稱取200 g，20℃浸泡提取2 h/次，共3次，合并濾液，濃縮至1 000 ml，加入KCl定容至終濃度0.5 mol/L，用HCl調(diào)pH 至4，靜置24 h，取沉淀部分減壓干燥即得KPC-rg1。

1.2.2 KPC-rg1細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn):Vero細(xì)胞鋪板，37℃，5%CO2培養(yǎng)過夜，設(shè)實(shí)驗(yàn)組、對照組、空白組，48 h后讀取OD值并計算細(xì)胞存活率。

1.2.3 KPC-rg1體外抗HSV-1病毒活性檢測:Vero細(xì)胞鋪板培養(yǎng)過夜，將 HSV-1懸液(MOI=5)或HSV-1與不同濃度KPC-rg1混合液滴定于細(xì)胞中吸附1.5 h，棄上清并洗3次，前者加入含不同濃度KPC-rg1的細(xì)胞維持液，后者僅加細(xì)胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)。48 h后顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，并計算病毒懸液的TCID50值。

1.2.4 KPC-rg1在HSV-1角膜感染模型中的藥效評價

1.2.4.1 小鼠角膜感染模型:72只小鼠，眼角膜給予空針劃傷后向結(jié)膜囊內(nèi)分別滴人PBS、5μl病毒懸液(滴度為1.0×104PFU/眼)或藥物+病毒懸液。1.2.4.2 樹鼩角膜感染模型:48只樹鼩，100 mg/kg的Ketamine麻醉后，對樹鼩進(jìn)行眼膜劃痕后將HSV-1病毒滴加于眼膜上(滴度為1.0×106PFU/眼)。

1.2.4.3 實(shí)驗(yàn)分組如下:①空白組②模型組③KPC-rg1組④HSV-1+KPC-rg1孵育組⑤ACV組⑥HSV-1+ACV孵育組。依據(jù)正常動物眼角膜藥物耐受預(yù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，小鼠模型③-⑥組均設(shè)置3個藥物濃度梯度(即0.2 μg/眼、1 μg/眼、4 μg/眼)，而樹鼩模型設(shè)2個濃度梯度(0.2μg/眼和4μg/眼)，每個濃度4只動物。

1.2.4.4 角膜炎分級或癥狀判斷參照Trousdale標(biāo)準(zhǔn)[4-5]。

1.2.5 KPC-rg1廣譜抗病毒活性篩選(由上海藥明康德新藥開發(fā)有限公司完成):除HCMV采用熒光衰減實(shí)驗(yàn)測定，其他8株病毒采用細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect，CPE)實(shí)驗(yàn)測定。KPC-rg1的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)與抗病毒活性篩選實(shí)驗(yàn)平行進(jìn)行，除了沒有病毒感染外，其他的實(shí)驗(yàn)條件與抗病毒實(shí)驗(yàn)一致。

圖1 KPC-rg1對Vero細(xì)胞增殖的抑制作用Fig.1 Inhibition of Vero cell proliferation by KPC-rg1

圖2 KPC-rg1或ACV給予被HSV-1感染細(xì)胞(A)和KPC-rg1或ACV與HSV-1共孵育后感染細(xì)胞(B)的病毒載量Fig.2 Viral load of HSV-1 infected cells after KPC-rg1 or ACV treated(A)and cells infected by HSV-1 co-incubated with KPC-rg1(B)

2 結(jié)果

2.1 KPC-rg1的細(xì)胞毒性 如圖1所示，當(dāng)KPC-rg1的濃度小于0.1 mg/ml時，對細(xì)胞生長基本無毒性，該劑量為進(jìn)行HSV-1體外抗病毒活性檢測提供了依據(jù)。

2.2 KPC-rg1對HSV-1的體外抗病毒活性 顯微鏡下，Vero細(xì)胞被HSV-1感染后呈現(xiàn)典型的細(xì)胞皺縮、變圓、碎裂等細(xì)胞病變現(xiàn)象。若被感染細(xì)胞分別加入 0.0001、0.001、0.01 mg/ml KPC-rg1 或 ACV，病毒載量下降2.2 vs 2.4倍、5.3 vs 5.6倍、6.5 vs 1335倍，呈劑量依賴性對細(xì)胞有保護(hù)作用(圖2)。

若HSV-1與KPC-rg1或ACV共孵育后再感染細(xì)胞，0.001～0.1 mg/ml KPC-rg1對細(xì)胞有明顯保護(hù)作用，其中0.001 mg/ml和0.01 mg/ml KPC-rg1分別使病毒載量下降5.6和238倍，而ACV在相同濃度下對細(xì)胞保護(hù)作用較KPC-rg1弱(圖2)。

2.3 KPC-rg1抗HSV-1體內(nèi)藥效評價

2.3.1 小鼠角膜感染模型:正常小鼠眼角膜藥物耐受預(yù)實(shí)驗(yàn)提示KPC-rg1濃度高于5μg/眼時出現(xiàn)嚴(yán)重刺激作用，故該實(shí)驗(yàn)設(shè)置給藥組為0.2μg/眼、1 μg/眼與4 μg/眼。

結(jié)果顯示:對照組HSV-1感染后第3天眼睛出現(xiàn)炎癥、水腫、伴有分泌物和糜面的發(fā)生。感染后第2天開始給藥，持續(xù)7 d，KPC-rg1未能改善角膜病變情況；HSV-1與KPC-rg1共孵育后能有效保護(hù)角膜，未觀察到病變。按角膜炎分級判斷標(biāo)準(zhǔn)，各組角膜病變評分統(tǒng)計見表2。

2.3.2 樹鼩HSV-1+角膜感染模型:在樹鼩角膜接種HSV-1后第9、12、19天檢查角膜病變并記錄評分(表3)。KPC-rg1對角膜病變的改善均不明顯，而HSV-1與KPC-rg1共孵育后能有效保護(hù)角膜，病變較輕微。

2.4 KPC-rg1廣譜抗病毒活性篩選 KPC-rg1對HIV-1、HCMV、RSV Along和 HSV-1 的 EC50分別為9.24 μg/ml， 42.55 μg/ml， 40.66 μg/ml和 32.74 μg/ml，具有明顯抗病毒活性，而對其他5株病毒沒有表現(xiàn)出抗病毒活性(表4)。

表2 測試病毒感染小鼠角膜病變比較(ˉ±s)Tab.2 Comparison of corneal lesions in each group of mouse infected by tested viruses(ˉ±s)

表2 測試病毒感染小鼠角膜病變比較(ˉ±s)Tab.2 Comparison of corneal lesions in each group of mouse infected by tested viruses(ˉ±s)

組別 造模前 4 d 6 d 8 d空白組 n=12 0±0 0±0 0±0 0±0模型組 n=12 0±0 2.25±0.45 3.5±0.43 3.79±0.33 KPC-rg1組(0.2μg/眼)，n=4 0±0 0.75±0.29 1.88±0.25 3.00±0.41 KPC-rg1組(1μg/眼)，n=4 0±0 1.00±0.41 2.25±0.65 3.25±0.29 KPC-rg1組(4μg/眼)，n=4 0±0 1.25±0.29 2.88±0.48 3.375±0.25 HSV-1+KPC-rg1孵育組(0.2μg/眼)，n=4 0±0 0 ±0 0±0 0±0 HSV-1+KPC-rg1孵育組(1μg/眼)，n=4 0±0 0±0 0±0 0±0 HSV-1+KPC-rg1孵育組(4μg/眼)，n=4 0±0 0±0 0±0 0±0 ACV組(0.2μg/眼)，n=4 0 ±0 0.625±0.25 0.875±0.25 1.00±0 ACV組(1μg/眼)，n=4 0±0 0.625±0.25 1.625±0.49 2.625±0.25 ACV組(4μg/眼)，n=4 0±0 1.00±0.41 3.00±0.41 3.875±0.25 HSV-1+ACV孵育組(0.2μg/眼)，n=4 0±0 0.50±0 1.00±0.41 1.125±0.25 HSV-1+ACV孵育組(1μg/眼)，n=4 0±0 0.625±0.25 2.375±0.25 3.125±0.25 HSV-1+ACV孵育組(4μg/眼)，n=4 0±0 0.50±0 3.625±0.25 3.75±0.29

表3 測試病毒感染樹鼩角膜癥狀比較(ˉ±s)Tab.3 Comparison of corneal lesions in each group of tree shrews infected by tested viruses(ˉ±s)

表3 測試病毒感染樹鼩角膜癥狀比較(ˉ±s)Tab.3 Comparison of corneal lesions in each group of tree shrews infected by tested viruses(ˉ±s)

組別 造模前 9 d 12 d 19 d空白組n=8 0±0 0±0 0±0 0±0模型組n=8 0±0 2.25±0.46 3.375±0.52 0.5±0.53 KPC-rg1組(0.2μg/眼)，n=4 0±0 1.75±0.5 1.5±0.58 0.25±0.5 KPC-rg1組(4μg/眼)，n=4 0±0 1.5±0.58 2.00±0.82 0.5±0.58 HSV-1+KPC-rg1孵育組(0.2μg/眼)，n=4 0±0 0.5±0.57 0.5±0.57 0±0 HSV-1+KPC-rg1孵育組(4μg/眼)，n=4 0±0 0±0 0±0 0±0 ACV組(0.2μg/眼)，n=4 0±0 0.75±0.5 0±0 0±0 ACV組(4μg/眼)，n=4 0±0 0.5±0.57 0.5±0.57 0.5±0.57 HSV-1+ACV孵育組(0.2μg/眼)，n=4 0±0 3.25±0.5 3.50±0.58 2.00±0.82 HSV-1+ACV孵育組(4μg/眼)，n=4 0±0 0.75±0.5 0.75±0.5 0.5±0.57

3 討論

肉桂是重要的藥用和食用植物，在我國地理分布廣，資源豐富。肉桂多酚作為肉桂中水溶性部分，具有多種藥理作用，包括抗糖尿病、抗氧化、抗腫瘤、神經(jīng)保護(hù)等[6]，但其抗病毒方面的報道則極少。2015年Zaidi小組發(fā)現(xiàn)肉桂水提物及其納米制劑在細(xì)胞水平上具有抗禽流感病毒H7N3的活性，但未與現(xiàn)有臨床用藥進(jìn)行比較[7]；2016年 Prakash與Lortat-Jacob小組研究發(fā)現(xiàn)從肉桂提取的原花青素A型多酚能通過結(jié)合HIV-1病毒外殼糖蛋白而阻止其進(jìn)入細(xì)胞，并可下調(diào)T細(xì)胞耗損標(biāo)記物Tim-3、PD-1而具有抗 HIV-1活性[8]；2017年 Baumert與 Moog發(fā)現(xiàn)該原花青素A型多酚還能抑制HCV進(jìn)入細(xì)胞，可能具有治療HCV感染的作用[9]，但兩項(xiàng)研究均未對其體內(nèi)抗病毒活性做進(jìn)一步探索。

本研究通過體外抗病毒活性和體內(nèi)抗病毒藥效研究評價了肉桂水提物KPC-rg1的抗HSV-1活性。首先，被 HSV-1感染的 Vero細(xì)胞加入 KPC-rg1(0.0001～1 mg/ml)后對病毒復(fù)制有抑制作用，而HSV-1與KPC-rg1(0.001～1 mg/ml)共孵育后能保護(hù)細(xì)胞不被感染。其次，KPC-rg1對HSV-1感染的動物(小鼠和樹鼩)角膜病變有一定的改善作用，而KPC-rg1與HSV-1共孵育后能完全保護(hù)動物不被感染。

通過丁達(dá)爾實(shí)驗(yàn)觀察到KPC-rg1是一種溶膠，推測其與病毒相遇后快速形成穩(wěn)定的KPC-rg1/病毒超納米顆粒結(jié)構(gòu)，使病毒失去感染細(xì)胞的能力。臨床上，HSV-1感染可分為原發(fā)型與復(fù)發(fā)型兩型。KPC-rg1可包裹HSV-1病毒并抑制其感染細(xì)胞的特性可減少潛伏或新增殖的病毒對機(jī)體造成損傷，緩解患者反復(fù)遭受病痛折磨。。

同時，本研究也顯示 KPC-rg1對 HCMV，RSV Along和HIV-1有顯著的抑制活性，提示KPC-rg1可能具有廣譜的抗包膜病毒活性，值得進(jìn)一步深入研究。

表4 KPC-rg1抗病毒活性和細(xì)胞毒性Tab.4 Antiviral activity and cytotoxicity of KPC-rg1 and references compound

利益沖突 無