熱比姑麗·伊斯拉木 美熱古麗·熱合曼 艾西木江·熱甫開提 買合蘇提·卡德爾 阿不都吉力力·阿布都艾尼

(1 新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所，烏魯木齊，830049； 2 新疆維吾爾醫(yī)方劑學(xué)實驗室，烏魯木齊，830049； 3 新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)醫(yī)院皮膚治療中心，烏魯木齊，830049)

銀屑病(Psoriasis)別名牛皮癬，是由多基因和多因素共同作用而引起的一種復(fù)雜的、特征性鱗屑性丘疹的慢性炎性皮膚病。近期臨床調(diào)研發(fā)現(xiàn)，本病發(fā)病率較高，病程也較長，而且容易復(fù)發(fā)，主要侵犯青壯年。本病不僅影響患者身體健康，更重要是對患者精神影響較大。所以，銀屑病是一種皮膚病領(lǐng)域重點探索的疾病。長期的臨床實踐已驗證，我區(qū)各家維吾爾醫(yī)醫(yī)院治療銀屑病方面有自己的特色和優(yōu)勢，積累了豐厚的實踐經(jīng)驗及成果，并形成了成熟異常體液和清除異常體液、活血化瘀和消除炎性反應(yīng)、止癢和抑制鱗屑為基本原則，及時采取調(diào)理療法、內(nèi)服外用藥物療法及非藥物療法、飲食療法和精神療法等一整套較成熟的綜合療法和技術(shù)。通過臨床實踐證明其綜合療法和技術(shù)療效確切，無明顯不良反應(yīng)[1-4]。我們分別采集我區(qū)維吾爾醫(yī)醫(yī)院維吾爾醫(yī)綜合治療的銀屑病患者和通過體檢確定健康志愿者血清，利用1H-NMR技術(shù)分析檢測健康志愿者、銀屑病患者血清差異性代謝組分，以提高我區(qū)維吾爾醫(yī)醫(yī)院銀屑病的療效。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年4月至2015年10月新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)醫(yī)院皮膚科住院銀屑病患者30例，均符合銀屑病診斷標(biāo)準(zhǔn)、納入及排除標(biāo)準(zhǔn)[5-6]。選取新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)醫(yī)院通過體檢確定的30名健康志愿者。均通過新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(2014-009)，以及健康志愿者和銀屑病患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑及儀器 1)重水(Deuteriumoxide，D2O)(美國Cambridge Isotop Laboratories,Inc)；2)5 mm核磁管(德國Bruker公司)；3)Inova 600兆超導(dǎo)核磁共振波譜儀(美國Varian公司)；4)核磁共振波譜儀工作站(美國Varian公司)；5)-80 ℃超低溫冰箱(中國海爾公司)；6)5424低溫高速離心機(jī)(德國Eppendorf股份公司)。

1.2.2 樣品收集及處理 收集銀屑病患者和健康志愿者早餐前空腹肘部靜脈血液，并分離血清，保存在-80 ℃低溫冰箱中待測。樣品從冰箱取出，在室溫解凍，取200 μL血清加400 μL磷酸鹽生理鹽水緩沖液(每100 mL生理鹽水0.045 mol K2HPO4和NaH2PO4，其溶液分別為80%的H2O和20% D2O，pH=7.4)混勻，室溫下靜置10 min；隨后，以10 000 r/min速度，半徑為5 cm，離心10 min。取550 μL上清液，加到5 mm核磁管內(nèi)。

1.2.3 核磁共振氫譜的測試 將上述已備好的核磁管放入儀器進(jìn)行1H-NMR譜檢測。本實驗1H-NMR圖譜測定均在Inova 600核磁共振波譜儀上用ID探頭采用弛豫編(Carr-Purcell-Meiboom-Gill，CPMG)脈沖序(RD-90°-τ-180°-2τ-180°-2τ-180°-…-ACQ)，25 ℃檢測溫度，599.15 MHz氫譜核磁共振頻率。對于樣品而言，共有32 768個采樣數(shù)據(jù)點，128次累加掃描次數(shù)，譜寬均為20 ppm，采樣時間均延遲2 s，1.64 s均作為采樣時間(AQ)，對所有樣品采用預(yù)飽和方法壓制水峰處理。為有利于解譜工作順利進(jìn)行，選取質(zhì)量較高的1H-NMR譜樣品進(jìn)行二維核磁共振圖譜的測試，包括1H-1H同核相關(guān)譜(1H-1H Homonuclear Correlation Spectroscopy，1H-1H COSY)，質(zhì)子全相關(guān)譜(Total Correlation Spectroscopy，TOCSY)和J-分解譜(J-Resolved Spectroscopic，J-RES)等用于譜圖中各種峰的指認(rèn)，以便于代謝成分的鑒定。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 基于原始1H-NMR圖譜數(shù)據(jù)量龐大、數(shù)據(jù)點的高度相關(guān)性以及溶劑峰等因素影響而不能直接用于模式識別分析，還需要對1H-NMR圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理。本實驗血樣1H-NMR圖譜數(shù)據(jù)采用0.3 Hz線寬的指數(shù)窗函數(shù)，首先進(jìn)行傅立葉變換，隨后進(jìn)行基線和相位調(diào)整。在血樣圖譜，以δ5.233pp質(zhì)子信號的ɑ-葡萄糖可作為參考定標(biāo)，在δ9.0～0.5范圍內(nèi)，對每δ0.003積分段進(jìn)行自動積分。同時，把積分值以文本格式保存，并導(dǎo)入Microsoft Excel內(nèi)。其中排除δ5.22～4.66范圍內(nèi)的1H-NMR譜水信號，其余積分值歸一化處理(每段積分值除總積分值)。采用SIMCA-P+11.0(Umetrics Inc.，Umea，瑞典)軟件包進(jìn)行正交偏最小二乘判別分析(Orthogonal partial least-squares discriminant analysis，OPLS-DA)，通過所有代謝物及相關(guān)系數(shù)，確定健康志愿者與銀屑病患者差異性代謝組分，檢驗水準(zhǔn)ɑ=0.05，R2Y和Q2所建立的模型的質(zhì)量評價指標(biāo)。本實驗通過Pearson相關(guān)系數(shù)顯著性檢驗的r與R臨界值，確定P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義的代謝產(chǎn)物臨界值。

2 結(jié)果

2.1 健康志愿者、銀屑病患者OPLS-DA模式分析 我們同樣地進(jìn)一步利用OPLS-DA建立模型的方法采用評估銀屑病患者與健康志愿者之間的代謝物差異，結(jié)果分別見圖1，2。結(jié)果顯示對健康志愿者與銀屑病患者之間有一定分離的趨勢，銀屑病患者區(qū)分程度和預(yù)測程度都可以達(dá)到要求(健康志愿者與銀屑病患者，模型預(yù)測參數(shù)分別為R2X=0.26，R2Y=0.73，Q2=0.53)。

圖1 健康志愿者及銀屑病患者血清OPLS-DA得分圖

注:▲為健康志愿者，■為銀屑病患者

圖2 健康志愿者及銀屑病患者血清OPLS-DA空間分布圖

注:▲為健康志愿者，■為銀屑病患者。模型預(yù)測參數(shù)分別為R2X=0.26，R2Y=0.73，Q2=0.53

表1 健康志愿者、銀屑病患者血清主要差異性代謝物及其相關(guān)系數(shù)

注:s,單峰;d,雙重峰;t,三重峰;q,四重峰;m,多重峰;dd,雙重雙重峰

2.2 健康志愿者、銀屑病患者標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)與鑒定 本實驗通過數(shù)據(jù)分析，在健康志愿者與銀屑病患者血樣品共發(fā)現(xiàn)12種差異性代謝物。與對照組比較，銀屑病患者血清極低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)、不飽和脂類、糖蛋白、酪氨酸、組氨酸及丙酮含量降低，與健康志愿者比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。此外，與健康志愿者比較，銀屑病患者血清乳酸、肌酸、甲酸、乙酸及苯丙氨酸含量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

3 討論

皮膚是人體最大、同樣也是重要的器官，使緊密地聯(lián)系機(jī)體內(nèi)外，并能敏銳地反映內(nèi)外變化情況。人體是一個整體，許多全身性疾病都可引起不同皮膚癥狀，同樣皮膚也可反映,甚至提示體內(nèi)存在的各種病理變化。隨著人們對銀屑病病因、發(fā)病機(jī)制的深入研究，逐步認(rèn)識到銀屑病不但是一種單純性皮膚病變，反而是以皮膚為主要表現(xiàn)的全身性、炎性反應(yīng)疾病。眾多研究發(fā)現(xiàn)，銀屑病容易伴發(fā)或并發(fā)代謝性疾病，如心血管系統(tǒng)疾病[7-8]、胰島素抵抗/糖尿病[9-10]、血脂代謝紊亂[11-12]、肥胖及代謝綜合征[13-14]。銀屑病患者代謝性疾病發(fā)生比例高于一般人群，因此，銀屑病是慢性炎性反應(yīng)皮膚病，而且也是系統(tǒng)性疾病，可伴發(fā)或并發(fā)代謝性疾病。銀屑病和代謝綜合征間可能存在遺傳、環(huán)境和免疫等方面關(guān)聯(lián)性。

Asha等[11]，Salihbegovic等[12]報道，銀屑病患者可能存在脂蛋白代謝紊亂、血脂水平升高、表皮中脂質(zhì)代謝不正常等，甚至闡明銀屑病患者易伴發(fā)高脂血癥、動脈粥樣硬化等疾病。提示，銀屑病患者體內(nèi)存在脂代謝紊亂，且其紊亂嚴(yán)重情況可能與疾病類型有關(guān)。本試驗結(jié)果顯示，銀屑病患者血清極低密度脂蛋白(VLDL)及低密度脂蛋白(LDL)水平降低，與健康志愿者血清水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，這與上述報道相似[11-12]。不飽和脂類水平降低，這與銀屑病患者急性發(fā)病期收治入院相符，其中作為能量儲備的脂類偏低可能與機(jī)體短期能量消耗大有關(guān)[15]。

王曉華等[16]，劉英等[17-18]檢測銀屑病患者血漿氨基酸差異性代謝組分，結(jié)果表明，銀屑病患者芳香族氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸)、支鏈氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸)、天門冬氨酸及賴氨酸升高，而蘇氨酸、甘氨酸降低，與健康志愿者水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果提示，銀屑病患者可能存在蛋白質(zhì)或氨基酸代謝紊亂。本試驗結(jié)果表明，銀屑病患者血清酪氨酸和組氨酸(生糖氨基酸)水平降低，肌酸和苯丙氨酸(必需氨基酸)水平升高，與健康志愿者血清水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，這與上述報道相似[16-18]。機(jī)體內(nèi)在特殊情況下，苯丙氨酸和酪氨酸可以相互轉(zhuǎn)化，故本實驗中2個芳香族氨基酸可能出現(xiàn)相對高低。銀屑病患者血清糖蛋白水平降低，與健康志愿者血清水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，這可能與銀屑病患者機(jī)體免疫功能低下有關(guān)。由于糖蛋白是蛋白質(zhì)的糖基化產(chǎn)物，參與機(jī)體的天然免疫反應(yīng)或獲得性免疫反應(yīng)，在機(jī)體內(nèi)疾病發(fā)生方面起著重要作用[19]。

本試驗結(jié)果顯示，銀屑病患者丙酮水平降低，乳酸水平升高，與健康志愿者血清水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。其原因是丙酮是脂類，尤其是脂肪酸在肝細(xì)胞內(nèi)氧化分解時產(chǎn)生的中間產(chǎn)物。丙酮一般易揮發(fā)，部分經(jīng)過肺臟、腎臟排除；其余部分丙酮進(jìn)入三羧酸循環(huán)，在一系列催化劑(酶)的作用下轉(zhuǎn)化為乳酸或丙酮酸，促進(jìn)糖異生。銀屑病患者乙酸水平升高，與健康志愿者血清水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，這可能與乙酸代謝異常是肝功能損傷的標(biāo)志，而銀屑病患者伴有肝功能的損害，與相關(guān)報道相似[18]。

總之，經(jīng)過我區(qū)維吾爾醫(yī)醫(yī)院維吾爾醫(yī)綜合治療的銀屑病患者血清氨基酸、脂類及其一些小分子化合仍出現(xiàn)代謝紊亂，這可能與銀屑病是一種常見的“慢性、復(fù)發(fā)性、炎性反應(yīng)性”疾病有關(guān)。通過血清代謝組學(xué)檢測實驗結(jié)果得知，臨床醫(yī)護(hù)人員應(yīng)該把人體作為一個整體來考慮，不但單獨治療銀屑病，而且也治療一些代謝紊亂所致的并發(fā)癥或并發(fā)癥、保護(hù)肝腎功能，有助于提高療效。同時，我們有必要分別對脂代謝紊亂、氨基酸代謝紊亂與銀屑病疾病類型之間的關(guān)系有待于深入研究。