聶 宇 周納新 劉 健 萬 峰 傅德皓

(1 湖北省宜昌市中心人民醫(yī)院骨科，宜昌，443000； 2 華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院，武漢，430022)

脊髓損傷(Spinal Cord Injury，SCI)是一種以損傷平面以下感覺、運動功能完全喪失和大小便失禁為主要臨床表現(xiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)嚴重創(chuàng)傷[1]。目前沒有有效的治療手段能恢復(fù)SCI的神經(jīng)功能。細胞因子信號抑制因子(Suppressors of Cytokine Signaling，SOCS)家族是一類對細胞因子信號通路具有負反饋調(diào)節(jié)作用的蛋白分子，參與多種細胞因子、生長因子和激素的信號調(diào)節(jié)[2]。近年來細胞因子信號抑制因子3(Suppressors of Cyto-kine Signaling-3，SOCS3)/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子3(Signal Transducer and Activator of Transcription-3,STAT3)信號通路在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用倍受關(guān)注。一般認為，該途徑廣泛參與神經(jīng)細胞的生長發(fā)育、分化及衰老等過程，并與腦腫瘤、缺血損傷等神經(jīng)系統(tǒng)病理過程密切相關(guān)[3]。丹參酮ⅡA是從丹參中提取的脂溶性有效成分之一，對細胞的生物學(xué)效應(yīng)已成為研究熱點[4]。為探討丹參酮ⅡA對大鼠急性脊髓損傷炎性反應(yīng)的影響，建立大鼠急性脊髓損傷模型，采用丹參酮ⅡA對大鼠進行干預(yù)，研究其對SOCS3/STAT3信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SD大鼠60只，雌雄不限，體重220～250 g，由華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院動物中心提供。動物房溫度18～25 ℃，濕度50%～75%，12 h交替光照，分籠飼養(yǎng)，自由飲水，普通飼料喂養(yǎng)，每日觀察動物進食情況，稱體重，及時清理糞便。本研究中動物處置方法符合動物倫理學(xué)標準。

1.1.2 藥物 丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液粉(杭州正大青春寶藥業(yè)有限公司，10 mg/瓶，國藥準字GR0532)。

1.1.3 試劑與儀器 大鼠細胞SOCS3 ELISA試劑盒(上海研盟生物科技有限公司，產(chǎn)品貨號：YMR30908)，大鼠細胞STAT3 ELISA試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，產(chǎn)品貨號：E-EL-R1226c)，提取mRNA試劑及反轉(zhuǎn)錄試劑(美國Invitrogen公司)，Viking神經(jīng)電生理儀(美國尼高利公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將SD大鼠60只按照隨機數(shù)字表隨機分為脊髓損傷組(對照組)、脊髓損傷/丹參酮IIA治療組(觀察組)2組，每組各30只。每組按時相分為5小組(n=6)。后正中切口，將T8-10椎板全部切除，顯露硬脊膜并保持其完整性。在硬膜表面放置一曲度相似的直徑為3.0 mm的圓形銅制墊片，用5 g的銅制重物在玻璃試管的引導(dǎo)下從8 cm處垂直自由落下，打擊墊片，致傷脊髓[5]。致傷沖量為40 gcf，造成中度脊髓損傷。術(shù)后見大鼠出現(xiàn)擺尾反射，雙下肢及軀體回縮撲動，雙下肢癱瘓表明撞擊成功。生理鹽水沖洗傷口，逐層縫合傷口。術(shù)后青霉素5萬U/只/d，注射3 d。損傷后每天10:00、17:00點2次人工膀胱排尿,直至建立反射性膀胱排空。各組大鼠在脊髓損傷后8 h、1 d、3 d、7 d、14 d取材，每組取6只。大鼠俯臥位置于特制臺上，背部剪毛，無菌操作，腰椎取背部正中切口，切除L2-L4雙側(cè)椎板，充分顯露L3-L4節(jié)段硬脊膜，背部正中腰椎部分切開，鈍性剝離腰椎周圍的肌肉，剪下腰椎，用咬骨鉗輕輕咬掉脊髓周圍的骨組織，快速取下脊髓組織，液氮保存。PBS液清洗，放入液氮罐中，備用。

1.2.2 給藥方法 脊髓損傷后30 min內(nèi)，觀察組大鼠經(jīng)腹腔注射丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液，給藥劑量計算方法：人的給藥劑量×人的轉(zhuǎn)換因子(36.8)/大鼠的轉(zhuǎn)換因子(6.9)=人的給藥劑量×5.3478。對照組注入等量生理鹽水。連續(xù)給藥10 d。

1.2.3 觀察指標 HE染色組織形態(tài)學(xué)觀察；采用Viking神經(jīng)電生理儀,行MEP檢測；用RT-PCR半定量分析脊髓組織中SOCS3mRNA、STAT3mRNA的表達；TUNEL法行神經(jīng)細胞凋亡檢測。

2 結(jié)果

2.1 2組大鼠大致觀察 術(shù)后所有動物均存活,飲食活動正常,未見手術(shù)部位破潰、紅腫等不良反應(yīng)。

2.2 2組大鼠組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn) 損傷后1 d損傷對照組脊髓灰質(zhì)部有廣泛灶性出血，大量紅細胞滲出,神經(jīng)元核濃縮，染色增強，隨時間推移逐漸出現(xiàn)神經(jīng)元固縮、壞死、溶解，細胞體積變小,有大量小膠質(zhì)細胞增生和中性粒細胞浸潤；白質(zhì)中也見較多紅細胞滲出，髓鞘腫脹和大量空泡,周圍有炎性細胞浸潤和膠質(zhì)細胞增生。觀察組損傷部位脊髓灰質(zhì)部腫脹變形、出血、炎性細胞浸潤較對照組輕,白質(zhì)點狀出血，白質(zhì)中有較多的正常軸突。

2.3 2組大鼠電生理學(xué)檢測結(jié)果比較 記錄術(shù)后各時點MEP波幅、潛伏期與術(shù)前比較所占的百分比，MEP波幅(%)=術(shù)后MEP波幅/術(shù)前MEP波幅×100% MEP潛伏期(%)=術(shù)后MEP潛伏期/術(shù)前MEP潛伏期×100%。1)觀察組在術(shù)后8 h、1 d、3 d、7 d、14 d時點MEP波幅(%)較對照組明顯增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。術(shù)后14 d，對照組MEP波幅為(77.00±5.16)%，觀察組為(89.27±6.02)%。2)觀察組和對照組各時點MEP潛伏期(%)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；隨著時間的推移2組MEP潛伏期均逐漸趨向正常，術(shù)后14 d，對照組MEP潛伏期為(101.05±1.18)%，觀察組為(100.33±1.25)%。見圖1、圖2。

2.4 2組大鼠SOCS3mRNA、STAT3mRNA的表達比較 對照組、觀察組SOCS3mRNA表達均增高，STAT3 mRNA表達均下降。但觀察組SOCS3mRNA表達明顯增高、STAT3mRNA表達明顯下降，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示丹參酮ⅡA具有促進SOCS3mRNA表達，抑制STAT3mRNA表達的作用。見表1。

表1 2組大鼠脊髓損傷不同時點的SOCS3mRNA、STAT3mRNA表達比較

注:與對照組比較，△P<0.05，△△P<0.01

表2 2組大鼠脊髓損傷不同時點的凋亡細胞數(shù)比較

注:與對照組比較，△P<0.05，△△P<0.01

圖1 脊髓損傷后MEP波幅%的時程變化(橫軸：時間；縱軸：MEP波幅%)

圖2 脊髓損傷后MEP潛伏期%的時程變化(橫軸：時間；縱軸：MEP潛伏期%)

2.5 TUNEL法神經(jīng)細胞凋亡檢測 2組TUNEL陽性細胞可見具有典型的凋亡特征性的改變，染色質(zhì)固縮，呈斑塊狀聚集于核膜周邊，胞質(zhì)濃染。對照組術(shù)后8 h開始有少量陽性細胞出現(xiàn)，1 d后逐漸增高，3 d增多顯著，7 d到達高峰，高峰時主要發(fā)生在白質(zhì)中膠質(zhì)細胞，以后呈下降趨勢。而觀察組TUNEL陽性細胞的數(shù)目明顯少于損傷對照組，3 d達到高峰，3～7 d維持在較高的水平，然后逐漸回落各時點凋亡指數(shù)分別進行比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)。見表2。

3 討論

丹參中主要包括水溶性酚酸類、脂溶性丹參酮類等有效成分[6]。丹參酮是中藥丹參根的乙醚提取物中的成分，為丹參主要有效成分，經(jīng)過大量藥理、毒理、有效成分及臨床研究證明，該藥對多種疾病尤其是有確切的療效，且毒性較小[7-8]。丹參酮ⅡA為丹參酮中主要有效成分之一,為脂溶性櫻紅色針狀結(jié)晶，可參與機體的多種生化反應(yīng)而有多種生物活性。具有抗炎、抑制細胞凋亡、降低氧自由基等作用，用于冠狀動脈粥樣硬化性心臟病及缺血性腦血管病的治療取得了較好療效。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究亦證實丹參酮丹參酮注射液可能通過促進血管內(nèi)皮生長因子表達，減少低氧誘導(dǎo)因子1-α的表達，改善脊髓缺血再灌注損傷組織局部缺氧環(huán)境，對減輕脊髓缺血再灌注損傷起到積極的防治作用[9]。

原發(fā)性脊髓損傷是指創(chuàng)傷本身造成的灰質(zhì)和白質(zhì)受損，神經(jīng)通路中斷；繼發(fā)性脊髓損傷是指創(chuàng)傷引起了局部一系列生化改變，使組織缺血、缺氧，膜脂質(zhì)過氧化，最終導(dǎo)致脊髓細胞死亡、退變、上行下行纖維傳導(dǎo)中斷[10]。凋亡以延遲的形式出現(xiàn)，研究證實，凋亡在SCI后繼發(fā)性損傷中扮演重要的角色，特別是大量白質(zhì)損傷致神經(jīng)缺失[11]。TUNEL陽性神經(jīng)元在原發(fā)性損傷后4～24 h觀測到，在傷后7 d出現(xiàn)繼發(fā)性少突膠質(zhì)細胞的凋亡[12]。因為少突膠質(zhì)細胞對髓鞘形成和保護這些長的透射纖維非常重要，SCI后少突膠質(zhì)細胞的丟失，導(dǎo)致余下神經(jīng)纖維束的變形，從而引起脊髓損傷平面以下的運動失控和感覺缺失。在本實驗中，丹參酮ⅡA觀察組神經(jīng)細胞凋亡率明顯比損傷對照組低。電生理檢測表明，MEP在觀察組較對照組有明顯恢復(fù)，這說明脊髓前部的運動傳導(dǎo)通路經(jīng)過治療后有所恢復(fù)，通過丹參酮ⅡA治療可以顯著降低急性脊髓損傷后神經(jīng)細胞凋亡的發(fā)生，減輕SCI所致的神經(jīng)功能的缺失。

SOCS3/STAT3信號通路主要作用機制是通過對細胞因子細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子途徑(Janus Kinase/signal Transducer and Activator of Transcription，JAK/STAT)途徑的負性調(diào)控而發(fā)揮作用[13]。這種負反饋作用主要通過以下3種途徑完成:1)利用和STAT相似的SH2結(jié)構(gòu)域,競爭結(jié)合細胞因子受體胞質(zhì)區(qū)的磷酸化tyr位點,阻礙STAT與受體結(jié)合位點結(jié)合,從而阻止STAT的活化；2)SOCS3可以抑制JAK激酶活性，阻斷JAK/STAT通路[14]。多個實驗表明，SOCS3可通過其結(jié)構(gòu)中的SH2部分，競爭性的與JAK2中JH1的酪氨酸殘基直接結(jié)合，實現(xiàn)其抑制JAK激酶活性的作用。也有反向?qū)嶒炞C實，如果去除N端靠近SH2結(jié)構(gòu)域的12個氨基酸結(jié)構(gòu)，SOCS3則失去此作用，因此間接證明SOCS3是通過SH2結(jié)構(gòu)實現(xiàn)其抑制JAK激酶，阻斷STAT磷酸化的作用的；3)通過C2末端同源區(qū)即SOCS盒與延伸蛋白復(fù)合體相互作用。延伸蛋白是一種泛酸酶的組成部分,將SOCS3結(jié)合的信號因子(如JAK和STAT等)通過泛酸化途徑降解,從而阻斷細胞因子的信號傳遞，調(diào)節(jié)神經(jīng)元的生長與分化。從而促進了興奮性神經(jīng)元凋亡中的作用。STAT3在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中亦廣泛分布[15]。

本實驗中，丹參酮ⅡA觀察組與對照組比較，SOCS3mRNA表達明顯增高，STAT3mRNA表達明顯下降，提示丹參酮ⅡA可通過SOCS3/STAT3信號通路，抑制炎性反應(yīng)，改善急性損傷脊髓組織的原發(fā)損害，改善病灶缺血、水腫，促進神經(jīng)細胞功能恢復(fù)，減輕脊髓繼發(fā)性損傷而起到急性脊髓損傷的保護作用。