何紅紅，馬宗桓，張元霞，張娟，盧世雄，張志強，趙鑫，吳玉霞，毛娟

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葡萄LBD基因家族的鑒定與表達分析

何紅紅，馬宗桓，張元霞，張娟，盧世雄，張志強，趙鑫，吳玉霞，毛娟

（甘肅農(nóng)業(yè)大學園藝學院，蘭州 730070）

【目的】通過生物信息學分析明確LBD轉(zhuǎn)錄因子在葡萄基因組中的數(shù)量、結構和非生物脅迫差異表達，為探究LBD轉(zhuǎn)錄因子在葡萄非生物脅迫中的作用奠定理論基礎?！痉椒ā扛鶕?jù)已經(jīng)報道的擬南芥LBD基因，利用葡萄基因組數(shù)據(jù)庫中的BLAST軟件鑒定葡萄基因組中的LBD基因。采用DNAMAN5.0、Clustalx、MapInspect、MEME、GSDS2.0、ExPASy和MEGA5.0等軟件進行生物信息學分析。利用PLEXdb中葡萄Affymetrix GeneChip 16K基因芯片數(shù)據(jù)繪制芯片表達譜。采用qRT-PCR方法檢測VvLBD基因家族在逆境脅迫中的表達情況?！窘Y果】從葡萄（L.）全基因組中鑒定得到30個LBD基因家族成員，可分為ClassⅠ和ClassⅡ兩類，ClassⅠ分為5個亞族，分別是Ⅰa、Ⅰb、Ⅰc、Ⅰd和Ⅰe，ClassⅡ分為2個亞族，分別是Ⅱa和Ⅱb。理化性質(zhì)分析表明，VvLBD基因家族編碼氨基酸數(shù)目介于127—386，理論等電點分布在4.77—9.28。定位分析發(fā)現(xiàn)，該基因家族的30個基因分布于葡萄19條染色體中的11條染色體上，其中第13染色體上分布最多，有7個基因。多序列比對和motif分析結果表明，VvLBD基因家族具有特定的3個保守結構域，分別是類鋅指結構、亮氨酸拉鏈結構和甘氨酸-丙氨酸-絲氨酸（GAS）結構。亞細胞定位分析表明，VvLBD基因家族主要在葉綠體、線粒體和細胞核中進行表達。VvLBD基因家族的二級結構主要以α-螺旋和不規(guī)則卷曲為主。VvLBD基因芯片表達譜分析發(fā)現(xiàn)，大部分基因在鹽脅迫和PEG脅迫下表達量上升，并且脅迫時間的長短對該基因家族成員的表達也存在差異。qRT-PCR分析結果表明，VvLBD基因家族成員中、、、、、在400 mmol·L-1NaCl處理條件下呈上調(diào)表達，表達量分別是對照的3、1、8、4、5和13倍，和在10% PEG處理條件下呈上調(diào)表達，表達量分別是對照的4和26倍?！窘Y論】從葡萄基因組中一共鑒定出30個LBD基因家族成員，分布于11條染色體上，并且結構進化高度保守；所有成員都與逆境相關，但是該基因家族成員在不同逆境脅迫下的響應程度存在一定的差異。

葡萄；LBD基因家族；進化分析；表達譜；實時熒光定量PCR

0 引言

【研究意義】葡萄（）是一個重要的經(jīng)濟作物，在全世界具有很高的經(jīng)濟價值，種植區(qū)域廣泛。然而中國西北地區(qū)存在許多不利于葡萄生長和結果的因素（如寒冷、干旱、鹽堿等）[1]，有針對性地進行非生物脅迫基因的研究和改造，可以抵御不利于葡萄生長的自然環(huán)境，從而提高和改善葡萄的產(chǎn)量和品質(zhì)?！厩叭搜芯窟M展】轉(zhuǎn)錄因子（transcription factors，TF）基因家族在植物的一些生物合成過程（如生長、發(fā)育、信號轉(zhuǎn)導和對環(huán)境壓力脅迫反應）中起著重要的作用。利用生物信息學研究葡萄基因家族的功能已在葡萄中大量報道，如、、、、、和等基因家族[2-8]。側生器官邊界域（lateral organ boundaries domain，LBD）基因也稱作AS2/LOB基因，是一類植物中所特有的轉(zhuǎn)錄因子基因家族[9]，該基因家族參與高等植物側生器官形態(tài)建成，特別是在側生器官與頂端分生組織之間邊界的形態(tài)建成起到關鍵作用[10-15]。在調(diào)控植物生長發(fā)育進程中，尤其在響應逆境脅迫中具有積極作用[16-18]。LBD基因包含3個特定的保守結構域，分別是類似鋅指的CX2CX6CX3C結構域、類似亮氨酸拉鏈（LX6LX3LX6L）的“螺旋卷曲”（coiled coil）二級結構和甘氨酸-丙氨酸-絲氨酸（GAS）區(qū)域[18-19]。目前，LBD基因已經(jīng)在許多植物中被鑒定，如擬南芥43個[10]、玉米44個[20]、毛果楊57個[21]、大麥24個[22]、辣椒45個[18]、番茄46個[16]和蒺藜苜蓿56個[23]。在擬南芥中，（）可調(diào)控擬南芥葉片早期的發(fā)育，（）可抑制近軸面區(qū)域的細胞增殖[24]，使葉片發(fā)育成兩面對稱的平展葉，受生長素和細胞分裂素誘導并調(diào)控擬南芥的激素響應[25-30]，通過響應硝酸鹽的合成，影響花青苷形成和氮素代謝[31-32]。在柑桔中，同源物可能通過調(diào)控參與擴增、生物合成和降解的細胞壁代謝基因的表達進而調(diào)控對細菌潰瘍病的耐藥性[33-34]。多種植物關于LBD基因芯片的表達分析表明該基因家族會響應不同的生物或非生物脅迫。番茄中，LBD基因在調(diào)控非生物脅迫時發(fā)揮重要作用[16]。苧麻中，16個BnLBDs能夠增加植株在高溫環(huán)境下的耐受力[35]。苜蓿中，幼苗期進行干旱處理，有一部分LBD基因在根的形態(tài)建成過程中變化差異較大[23]。辣椒中，LBD基因中ClassⅠ在響應高溫脅迫時明顯低于ClassⅡ，且在不同時長的高溫脅迫下其表達量存在差異[17]。大豆中，受干旱、低溫、鹽堿和各種激素的強烈誘導[36]?！颈狙芯壳腥朦c】目前，葡萄LBD基因家族雖有報道[37-38]，但其主要是對基因芯片表達譜數(shù)據(jù)的分析研究，定量分析研究較少[38]，尤其是對逆境脅迫下表達的分析鮮見報道?！緮M解決的關鍵問題】本研究利用生物信息學方法探究VvLBD基因家族的分布、基因結構與表達分析，通過芯片表達譜進行基因在非生物脅迫下的功能預測，分析VvLBD基因家族在試管苗葡萄葉片中的表達情況，為VvLBD基因家族響應逆境脅迫時的功能奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2016—2017年進行。熒光定量所用試驗材料為‘紅地球’葡萄（‘Red Globe’）試管苗，保存于甘肅農(nóng)業(yè)大學果樹生理與生物技術實驗室。將試管苗單芽莖段接于固體GS培養(yǎng)基上，分別置于LED白光下培養(yǎng)35 d后，分別用50 μmol·L-1ABA、400 mmol·L-1NaCl以及10%PEG處理24 h，每個處理設置3組重復，等體積蒸餾水處理為對照。

基因芯片表達譜所用試驗數(shù)據(jù)取自于GEO數(shù)據(jù)庫中的GSE31594和GSE31662，其試驗材料為‘赤霞珠’葡萄（）。GSE31662數(shù)據(jù)是‘赤霞珠’軟化的綠色漿果在培養(yǎng)皿中離體培養(yǎng)，在培養(yǎng)皿中加入0.3 mol·L-1蔗糖+脫落酸（ABA）作為處理，未處理的作為對照（CK1），每個處理設置3個重復，在處理后的3和10 d分別進行取樣。GSE31594數(shù)據(jù)是‘赤霞珠’生長在水培滴灌系統(tǒng)中，用120 mmol·L-1（10﹕1 NaCl﹕CaCl）、聚乙二醇（PEG）和低溫（5℃）分別進行處理，未處理的作為對照（CK2），每個處理設置3個重復。分別在1、4、8和24 h采集葉片，其中24 h不用低溫處理。

1.2 葡萄LBD基因家族成員鑒定

根據(jù)文獻獲得擬南芥（）的LBD基因ID[18]。并從NCBI網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm. nih.gov/nuccore/NM_113577.4）獲得每一條基因?qū)腃DS與Full-length的序列。將獲得的CDS序列提交到葡萄基因庫中，同源搜索VvLBD基因，獲取已知序列的基因號、CDS長度、氨基酸數(shù)目、cDNA和Full-length，保留長度大于1 000 bp的序列。并運用DANMAN進行多重比對，依據(jù)LBD基因家族所具有的特定結構域，手動去除不含有LBD特定結構域或者結構域不完整的序列。利用ExPASy（http：//web.expasy.org/protparam/）在線軟件對葡萄LBD蛋白的分子量和等電點進行預測。從葡萄基因組網(wǎng)站獲取染色體基本信息，選取LBD基因的位置信息，利用MapInspect程序繪制其染色體物理位置圖。

1.3 葡萄LBD基因家族進化、基因結構、motif和亞細胞定位分析

利用Clustal x對葡萄和TAIR（http://www. arabidopsis.org/）中擬南芥LBD蛋白進行多序列比對，使用MEGA5.0構建LBD家族系統(tǒng)發(fā)育樹[35]，Bootstrap值設置為1 000。在線軟件GSDS2.0（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）用于分析基因結構[39]。用DNAMAN進行結構域序列多重比對，采用（http://meme-suite.org/tools/meme）進行motif序列分析；采用WoLF PSORT進行亞細胞定位（http://www. genscript.com/wolf-psort.html）。

1.4 葡萄LBD基因家族基因芯片表達模式分析

從NCBI的GEO數(shù)據(jù)庫中下載葡萄RNASeq數(shù)據(jù)，登錄號為GSE31662和GSE31594，用核酸序列為探針檢索出序列相同的Affymetrix GeneChip 16K基因ID，然后提取在各種非生物脅迫下的RNASeq數(shù)據(jù)，通過Excel對數(shù)據(jù)進行l(wèi)og2轉(zhuǎn)換，最后用HemI制作表達熱圖（heatmap）。

1.5 實時熒光定量PCR

對VvLBD基因家族的CDS序列進行引物設計（表1）。cDNA合成用Prime Script RT reagent Kit（Perfect Real Time）試劑盒（TaKaRa）。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物-20℃保存?zhèn)溆谩崟r熒光定量PCR（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction, qRT-PCR）應用Bio-Rad iCycler iQ實時定量PCR儀進行擴增，以葡萄為內(nèi)參[40]，擴增體系為2 μL cDNA、上下游引物各1 μL、SYBR 10 μL反應MIX和6 μL ddH2O。反應程序為95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s，共40個循環(huán)。3次重復，數(shù)據(jù)用Excel軟件分析。

1.6 試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析，采用單因素（One-way ANOVO）的Duncan’s法進行顯著性差異分析，顯著性水平為＜0.05，并作圖。

2 結果

2.1 葡萄LBD基因家族的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

經(jīng)同源搜索獲得30個，分別命名為—。通過對染色體進行定位分析（圖1），發(fā)現(xiàn)該家族30個基因分布于葡萄11條染色體上（Chr.01、Chr.03、Chr.06、Chr.07、Chr.08、Chr.13、Chr.14、Chr.15、Chr.16、Chr.17和Chr.18），其中第13染色體上有7個基因（、、、、、和）。在第3、第8和第18染色體上分別含有1個基因，有2個基因分布在未知染色體上。VvLBD1蛋白序列最長，包含386個氨基酸殘基，VvLBD13蛋白序列最短，含127個氨基酸殘基。分子量為14.19636—43.30087 kD；等電點介于4.77—9.28。外顯子數(shù)介于1—4，的外顯子數(shù)是4，的外顯子數(shù)是1，外顯子數(shù)為2的有18個基因，外顯子數(shù)為3的有10個基因（表2）。說明該轉(zhuǎn)錄因子基因家族是一個相對保守的基因家族。

表1 VvLBD基因家族表達分析的實時熒光定量引物

2.2 葡萄LBD基因家族多序列比對分析

通過對30個VvLBD蛋白序列進行多序列比對，發(fā)現(xiàn)VvLBD蛋白序列的N端都含有1個由15個氨基酸組成的保守CX2CX6CX3C序列（圖2），預測其可能直接參與下游基因順式元件的結合，說明30個基因家族功能域完整。ClassⅠ類蛋白結構域C端含有賴氨酸組成的類似亮氨酸拉鏈LX6LX3LX6L螺旋卷曲結構（圖2）。大部分VvLBD蛋白都具有GAS保守結構，—、—、、—的序列是GAS結構，GAS保守結構區(qū)域中，、、、、和的序列是GRA，的序列是GRS結構，進一步說明該基因家族序列高度保守，在葡萄體內(nèi)可能行使相似的功能。

圖1 葡萄LBD基因家族在染色體上的位置

2.3 葡萄LBD基因家族基因結構和進化分析

通過對VvLBD基因家族基因進行結構分析，結果表明，30個VvLBD基因分為兩類，分為為ClassⅠ和ClassⅡ，分別含有23個和7個LBD蛋白。在葡萄LBD基因家族中有10個旁系同源系基因，其中有4對旁系同源系基因/、/、/、/的自展值高于90。如圖3所示，基因結構分析發(fā)現(xiàn)葡萄LBD基因結構內(nèi)含子數(shù)均小于3個，外顯子數(shù)約為4個，但不含內(nèi)含子。有18個基因（、—、—、—、—、—）僅含1個內(nèi)含子，有10個基因（、、、—、—、—）含有2個內(nèi)含子，只有含有3個內(nèi)含子。聚類關系較近的基因具有相似的基因結構，如7個ClassⅡ基因中的、和含有1個內(nèi)含子，、、和含有2個內(nèi)含子，且內(nèi)含子結構高度相似。在10個旁系同源系中自展值大于90的4對基因結構也高度相似，分別為/、/、/和/。

表2 葡萄中LBD轉(zhuǎn)錄因子家族信息

圖2 葡萄LBD家族保守結構域比對

圖3 葡萄LBD家族進化樹及基因結構

為進一步了解VvLBD基因家族的進化特性，利用擬南芥LBD基因家族成員與葡萄LBD基因家族成員構建系統(tǒng)進化樹（圖4）。將葡萄ClassⅠ分為Ⅰa、Ⅰb、Ⅰc、Ⅰd和Ⅰe等5個亞類，分別包含6、2、6、4和5個VvLBD家族成員，ClassⅡ分為Ⅱa和Ⅱb 2個亞類，分別包含3和4個VvLBD家族成員，說明VvLBD基因家族成員之間即高度保守，又存在一定的差異，這與基因家族的功能有相似之處。

2.4 葡萄LBD基因家族motif序列分析

VvLBD基因家族中最主要的motif有3個（圖5-A）：C端均含有一個保守的半胱氨酸殘基組成的鋅指結構CX2CX6CX3C（motif 2）基序,推測其可能直接與基因順式作用元件相接合；一個完全保守的GAS（Gly-Ala-Ser）保守結構（motif 1）；N端為一個類似亮氨酸拉鏈的螺旋卷曲結構亮氨酸拉鏈式基序LX6LX3LX6L（motif 3），可能參與轉(zhuǎn)錄因子的二聚化過程。圖5-B為MEME搜索得到的8個模體，motif 1和motif 2在所有成員中均有出現(xiàn)，motif 3只出現(xiàn)在大多數(shù)ClassⅠ成員當中，motif 4分布在ClassⅡ的所有成員中，motif 5出現(xiàn)在ClassⅡ的4個基因中，motif 6出現(xiàn)在ClassⅡ的3個基因中，motif 7主要出現(xiàn)在ClassⅠ中的部分成員中，motif 8只出現(xiàn)在ClassⅠ中的第四對旁系同源系的2個基因中。雖然不同亞族中包含motif種類和motif的排列順序不同，但是同一亞族中，均包含相同的motif排列，這可能與該基因家族功能的表達方面有很大的關系。

圖4 葡萄（●）與擬南芥（○）LBD轉(zhuǎn)錄因子的系統(tǒng)進化樹分析

A：葡萄LBD基因家族motif分析；B：MEME預測的8個保守位點LOGO圖

2.5 葡萄LBD基因家族亞細胞定位和蛋白質(zhì)二級結構分析

VvLBD基因家族主要集中在葉綠體、線粒體和細胞核中進行表達（表3），說明該基因家族主要存在于光合、呼吸代謝較強的器官中。其中VvLBD基因家族在細胞質(zhì)中表達的基因只有、、、、、、和；在葉綠體中除了和沒有表達外，其余基因均有表達；在細胞核中除了、、、中沒有表達，其余基因均有表達；在線粒體中除了、、、、、、、、和這10個基因沒有表達外，其他基因均有表達；在過氧化物酶體、液泡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體和細胞基中都沒有表達；在細胞骨架中表達的基因只有，說明其可能參與了細胞壁的形成。

表3 葡LBD基因亞細胞定位預測

VvLBD基因家族編碼蛋白質(zhì)的二級結構主要有α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角與不規(guī)則卷曲。VvLBD基因家族編碼的30個蛋白主要是α-螺旋（20.66%—56.36%）和不規(guī)則卷曲（26.77%—53.72%），β-轉(zhuǎn)角較少（0— 12.96%）（表4）。

2.6 葡萄LBD基因家族表達模式分析

從葡萄基因組數(shù)據(jù)庫中克隆出30個LBD基因，對其中29條VvLBD（未在芯片數(shù)據(jù)檢索到）基因進行芯片表達模式的分析（圖6），在ABA脅迫下，和的表達量明顯上調(diào)，而、、、、、的表達量明顯下調(diào)；在鹽、PEG、低溫脅迫下，、、、、、、、、、和的表達量明顯上調(diào)，、和的表達量明顯下調(diào)。此外，逆境脅迫時間的長短對VvLBD基因家族的表達也存在不同的影響，如在ABA脅迫4 h的表達和對照（CK1）無差異，而在ABA處理8 h的表達量明顯比對照（CK1）下調(diào)趨勢；在鹽和PEG處理24 h后表達量明顯高于對照（CK2）。在1 h鹽脅迫下的表達量和對照（CK2）相同，而在4、5和6 h鹽脅迫下的表達量明顯比對照（CK2）有所下調(diào)，說明該基因家族成員響應不同逆境脅迫和不同脅迫時間的反應機制之間存在差異。

表4 葡萄LBD蛋白二級結構分析

圖中用深藍、淺藍、無色、淺紅、深紅五色代表基因表達水平。藍色表示基因表達弱，紅色表示基因表達強

2.7 葡萄LBD基因的實時熒光定量分析

VvLBD基因家族受NaCl、ABA和PEG的誘導，各處理間表達量具有較顯著的差異，在400 mmol·L-1NaCl處理24 h條件下，VvLBD基因家族明顯上調(diào)表達（圖7）?！?、—、—、—、—、、—在50 μmol·L-1ABA、400 mmol·L-1NaCl和10% PEG處理24 h后，均呈下調(diào)表達。和在ABA、NaCl和PEG處理后，均呈上調(diào)表達。在PEG處理后，呈上調(diào)表達。、—、—在NaCl處理后，呈現(xiàn)出明顯上調(diào)表達，而在ABA和PEG處理后，呈現(xiàn)出明顯下調(diào)表達。在ABA、NaCl和PEG處理24 h后，均呈上調(diào)表達，且在NaCl處理后，表達量是對照的8倍；在ABA處理后，表達量是對照的5倍；在PEG處理后，表達量是對照的3倍。結果表明，在VvLBD基因家族成員中，部分基因受400 mmol·L-1NaCl、50 μmol·L-1ABA、10%PEG的強烈誘導；部分基因?qū)?00 mmol·L-1NaCl、50 μmol·L-1ABA和10%PEG的脅迫并不敏感。

A：對照；B：400 mmol·L-1NaCl處理24 h；C：50 μmol·L-1ABA處理24 h；D：10%PEG處理24 h

A: Control; B: 24 h treatment by 400 mmol·L-1NaCl; C: 24 h treatment by 50 μmol·L-1ABA; D: 24 h treatment by 10%PEG

圖7 葡萄LBD基因在不同處理下的表達

Fig.7gene expression under different treatment

3 討論

本研究通過已知擬南芥LBD蛋白序列從葡萄基因組數(shù)據(jù)庫中同源搜索到30個VvLBD基因，Grimplet等[38]研究結果表明，VvLBD基因家族成員有50個，并對VvLBD基因家族的生物信息學分析，利用基因芯片數(shù)據(jù)分析、組織表達和逆境脅迫等多方面功能的預測，但是通過比較分析發(fā)現(xiàn)，其中大部分基因結構是不完整的，因此未對基因的功能進行確切的驗證。本研究通過去掉一些結構域不存在的序列后，用實時熒光定量法對葡萄試管苗進行了非生物脅迫的相關功能驗證。結果表明，30個VvLBD基因在染色體上所處的位置均有所差異，理化性質(zhì)也存在一定的差異。通過VvLBD基因家族多序列比對，發(fā)現(xiàn)它與擬南芥、玉米、番茄具有相似的結構域，推測VvLBD基因與它們可能具有相似的功能[16, 20-21]。在ClassⅠ的VvLBD基因家族成員中，LOB 結構域的C端大部分包含有一個類似亮氨酸拉鏈的LX6LX3LX6L螺旋卷曲二級結構，這可能與轉(zhuǎn)錄因子間的二聚化相關[16-17]，而VvLBD基因家族中7個ClassⅡ成員均不含該結構域，這與普通煙草中研究結果有相似的特點[41]。本試驗對VvLBD基因家族和擬南芥基因家族進行聚類分析，結果表明，在葡萄中ClassⅠ有對自展值在95以上的直系同源系基因/。Thatcher等[15]研究結果表明，在擬南芥中對尖孢鐮刀桿菌的防御過程中發(fā)揮著負調(diào)控作用。Zhu等[43]認為（）和（）的表達在擬南芥中受生長素誘導，同時聚類于ClassⅠ中，相對應的葡萄LBD同源基因和可能具有相似的功能。VvLBD基因結構分析表明聚類關系較近的基因具有相似的基因結構，這與番茄LBD基因家族的聚類分析結果相近[16]。對VvLBD基因家族編碼蛋白質(zhì)二級結構進行預測，發(fā)現(xiàn)該基因編碼蛋白質(zhì)以α-螺旋和不規(guī)則卷曲為主。motif序列分析表明，在VvLBD基因家族中主要存在3個保守序列，分別是GAS保守結構域、鋅指結構域和亮氨酸拉鏈卷曲螺旋基序[10,41-42]。說明該基因家族與水稻、玉米和大麥的LBD基因家族高度相似。

本研究對葡萄LBD基因芯片數(shù)據(jù)進行分析，結果表明，在非生物脅迫條件下，該基因家族在葡萄果皮和葉片中表達，在ABA脅迫下，‘赤霞珠’漿果果皮中的表達量最高。在鹽、ABA、PEG和低溫脅迫下，在‘赤霞珠’葉片中，、、和的表達量最高，其中、和都在ClassⅡ亞族中，研究結果與擬南芥、水稻等植物LBD家族的表達模式相似[17,43]。但是，不同時長的逆境脅迫可以使葡萄LBD基因有不一樣的表達情況，如：在ABA脅迫4 h的表達和對照（CK1）無差異，而在ABA處理8 h的表達量明顯比對照（CK1）下調(diào)；在1 h鹽脅迫下的表達量和對照（CK2）一樣，而在4、5和6 h鹽脅迫下的表達量明顯比對照（CK2）有所下調(diào)（圖6）。

AtLBD蛋白參與調(diào)控植物生長發(fā)育的多種過程，在胚胎形成、側生組織發(fā)育、花青苷合成以及氮代謝過程報道的較多[44-45]，然而對于LBD基因應對非生物脅迫響應的研究較少。在ClassⅠa亞族中的和ClassⅠd亞族中的，在50 μmol·L-1ABA、400 mmol·L-1NaCl和10% PEG處理24 h后，各處理間的表達沒有顯著差異。葡萄、、—，在400 mmol·L-1NaCl處理24 h后呈現(xiàn)明顯上調(diào)趨勢，葡萄—、—、—、、—、、，在50 μmol·L-1ABA、400 mmol·L-1NaCl和10%PEG處理24 h后呈現(xiàn)出下調(diào)趨勢。只在10%PEG處理24 h后基因表達呈現(xiàn)上調(diào)趨勢，且表達量是對照的26倍。Grimplet等[38]研究結果表明5在漿果果皮中表達，并且在外源ABA處理下表現(xiàn)出正調(diào)控作用，而在本文的定量分析中發(fā)現(xiàn)在外源ABA處理下的表達量并沒有顯著的變化（對應著本文研究的）。以上研究結果與Cao等[37]有關VvLBD基因家族關于逆境脅迫的研究成果有相似之處。本研究表明，在ClassⅠ和ClassⅡ2個亞族中的VvLBD基因?qū)?00 mmol·L-1NaCl脅迫24 h后上調(diào)表達較為強烈，而對于ABA、PEG的脅迫下的相對表達下調(diào)趨勢較為明顯。推測VvLBD基因家族的ClassⅠ和ClassⅡ 2個亞族都參與了逆境脅迫應答，且在不同植物中LBD基因存在不同的調(diào)控機制。

4 結論

獲得30個VvLBD基因家族成員，且含有保守結構域，可分為2大類和7個亞類。除在細胞骨架中表達以外，其他基因主要在葉綠體、線粒體和細胞核中表達。在響應不同時長不同逆境脅迫時，不同的基因起到不同的表達調(diào)控作用。

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Identification and Expression Analysis of LBD Gene Family in Grape

HE HongHong, MA ZongHuan, ZHANG YuanXia, ZHANG Juan, LU ShiXiong, ZHANG ZhiQiang, ZHAO Xin, WU YuXia, MAO Juan

(College of horticulture, Gansu Agricultural University, Lanzhou, 730070)

【Objective】The objectives of this research are to identify the Lateral Organ Boundaries Domain(LBD) family genes from grape() genome, to know the profile of LBD family such as gene number, gene structure and abiotic stress expression characteristics in grape, and to provide theoretical basis for exploring what roles the LBD transcription factors play in abiotic stress of grape.【Method】The LBDgenes in grape genome-wide were identified by BLAST software in the grape genome database based ongenes have been reported from.DNAMAN5.0, Clustalx, MapInspect, MEME, GSDS2.0, ExPASy and MEGA5.0 software were used for carry out various bioinformatics analysis of LBD. The expression profile chip was draw by the data comes from Affymetrix Gene Chip 16K in PLEXdb.The qRT-PCR was used to detect the expression of grape LBD gene family in abiotic stress.【Result】Total of 30 LBD genes were identified from grape genome, which can be divided into ClassⅠand ClassⅡ. The classⅠcan be divided into 5 subtribe which are namedⅠa,Ⅰb,Ⅰc,Ⅰd andⅠe. ClassⅡ can be divided into Ⅱa and Ⅱb. The number of amino acids is between 127 and 386, and the theoretical equivalence point is between 4.77 and 9.28 in the VvLBD gene family by physicochemical analysis. The analysis of the gene's location on the chromosome revealed that the 30 genes in this family were distributed on 11 of the 19 chromosomes of the grape, and the chromosome 13 contains 7 genes. Multiple sequence alignments and Motif analysis showed that the VvLBD gene family has three conserved domains, namely the sinusoidal structure, the leucine zipper structure, and the Glycine-alanine-serine (GAS) structure. The VvLBD gene family is mainly expressed in chloroplast, mitochondria and nucleus through the sub-cellular location analyzing. The alpha-helix and irregular curl are the main structure of the secondary structure in thegene family. The expression of the most gene was increased under the salt and PEG stress, and the expression characteristic was changed by the stress time change in the chip expression profile. The qRT-PCR results showed the expression of,,,,,were raised to the 3, 1, 8, 4, 5, and 13 times compared the control under the 400 mmol.L-1NaCl treatment. The expression ofandwas raised to the 4 and 26 times compared the controlunder 10% PEG treatment.【Conclusion】30 LBD gene family members were identified from the grape genome. These members distributed on 11 of the 19 chromosomes of the grape and the evolution of VvLBDis highly conservative. The LBD gene family is related to the abiotic stress, but the different expression were existed between the different members when the encountered the adversity environments.

; LBD gene family; evolutionary analysis; expression profile; qRT-PCR

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.21.009

2018-04-28；

2018-06-25

甘肅農(nóng)業(yè)大學大學生科研訓練項目、國家自然科學基金（31460500）

何紅紅，E-mail：1152420683@qq.com。通信作者毛娟，E-mail：maojuan@gsau.edu.cn

（責任編輯 李莉）