周 霖 熊 勇 梁 敏 石波云

結(jié)直腸癌(Colorectal cancer)是最常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，是世界范圍內(nèi)發(fā)病率及死亡率均位居前三的惡性腫瘤[1]。我國(guó)結(jié)直腸癌發(fā)病率呈逐年緩慢上升趨勢(shì)[2]。TNM分期是判斷腫瘤預(yù)后和指導(dǎo)治療的重要依據(jù)[3]，II期患者占結(jié)直腸癌發(fā)病率的30%～40%，但I(xiàn)I期結(jié)直腸癌患者治療尚無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)且相當(dāng)一部分患者無(wú)法從化療中獲得收益，根治性手術(shù)后是否行輔助化療也存在極大爭(zhēng)議[4]。其中仍有20%的II期患者在接收根治性手術(shù)后出現(xiàn)腫瘤的遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移[5]。III期患者性根治性手術(shù)后常規(guī)性輔助化療，但仍有高達(dá)37%患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)[6]。而傳統(tǒng)的TNM分期主要依據(jù)是患者腫瘤的解剖部位，在決策治療方式及判斷患者預(yù)后時(shí)存在一定局限性。近年來(lái)，腫瘤分子標(biāo)志物在臨床的應(yīng)用受到了越來(lái)越多的關(guān)注[7-9]。因此，尋找有效的腫瘤分子標(biāo)志物作為對(duì)TNM系統(tǒng)的補(bǔ)充有助于結(jié)直腸癌患者的個(gè)體化治療，對(duì)結(jié)直腸癌的診療具有重要意義。

Ras超家族蛋白參與了細(xì)胞的增值、分化、腫瘤形成[10]。越來(lái)越多的研究證明Ras蛋白的的持續(xù)活化在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[11-13]。 Rce(Ras-converting enzyme 1)是一種水解內(nèi)切酶，主要參與Ras超家族的激活[14]?，F(xiàn)有研究證明Rce1與前列腺癌的不良預(yù)后相關(guān)且可促進(jìn)腎癌細(xì)胞的增殖及侵襲性[15-16]。而Rce1在結(jié)直腸癌中的作用尚未清楚。本研究通過(guò)免疫組化方法檢測(cè)結(jié)直腸癌患者腫瘤及其匹配癌旁組織中的Rce1表達(dá)情況，分析Rce1與患者臨床病例參數(shù)的關(guān)系，探究Rce1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況及意義。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

研究石蠟標(biāo)本來(lái)自廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院2009年1月—2016年11月接受結(jié)直腸癌根治術(shù)的患者237例，標(biāo)本包括腫瘤組織和癌旁組織，經(jīng)病理復(fù)查確診為結(jié)直腸癌。其中男91例，女146例?；颊叩募{入標(biāo)準(zhǔn)為：①根治性術(shù)后的患者；②術(shù)后病理明確診斷為結(jié)直腸腺癌；③患者術(shù)前無(wú)新輔助化療、放療等抗腫瘤治療，術(shù)后高危患者均接收術(shù)后輔助化療；④術(shù)后隨訪資料完全。排除標(biāo)準(zhǔn)：①隨訪中死于非結(jié)直腸癌的患者；②同時(shí)或異時(shí)伴發(fā)其他惡性腫瘤的患者；③圍手術(shù)期死于嚴(yán)重并發(fā)癥的患者。

1.2 抗體與主要試劑

兔抗人Rce1單克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz公司；鼠抗人β-action購(gòu)置Sigma公司；免疫組化試劑盒及顯色液購(gòu)自背景中杉金橋生物公司。

1.3 免疫組化檢測(cè)

免疫組化檢測(cè)方法(IHC)。結(jié)直腸癌組織標(biāo)本經(jīng)甲醛溶液固定，石蠟包埋，連續(xù)切片成4 μm厚度；烤箱62 ℃下烘烤2 h后，二甲苯脫蠟、酒精梯度水化后，在3%的過(guò)氧化氫溶液中浸泡15 min以消除組織標(biāo)本中的過(guò)氧化物酶，從而減少非特異性染色；繼而以0.01 moL/檸檬酸溶液(Ph=6.0)煮沸修復(fù)30 min。山羊血清封閉1 h后，滴加Rce1一抗(1 ∶50稀釋)，4 ℃過(guò)夜；出去一抗用生物素標(biāo)記的二抗在37 ℃下恒溫孵育30 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹(shù)脂封片。同一顯微鏡以低倍鏡觀察全片，后隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野觀察染色情況，根據(jù)染色程度及染色百分比經(jīng)行評(píng)定，腫瘤染色強(qiáng)度分為：無(wú)染色0分，著色淡1分，棕黃色2分，棕褐色3

分；并結(jié)合腫瘤染色范圍0%～100%綜合判定，總分?jǐn)?shù)≤1.5分為陰性，>1.5分為陽(yáng)性。

1.4 臨床病理資料

收集237例結(jié)直腸癌患者的完整病理資料，選取了腫瘤浸潤(rùn)深度、病理分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、CEA、CA19-9等八項(xiàng)臨床病例參數(shù)。通過(guò)分析Rce1的表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系來(lái)探討Rce1在結(jié)直腸癌發(fā)展中可能發(fā)揮的作用。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Rce1在結(jié)直腸癌組織及癌旁組織中表達(dá)情況

免疫組化結(jié)果顯示：Rce1蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞漿，結(jié)直腸癌中Rce1表達(dá)率為54.9%，明顯低于癌旁組織78.9%，Rce1在結(jié)直腸癌組織中呈低表達(dá)狀態(tài)(P<0.05；圖1D)。

2.2 Rce1蛋白表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系

低表達(dá)Rce1提示不良預(yù)后。通過(guò)Kaplan-Meier生存分析法分析Rce1表達(dá)狀態(tài)與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果如圖2所示，高表達(dá)Rce1蛋白的患者其5年總體生存率及無(wú)瘤生存率均好于Rce1低表達(dá)的患者(圖2A和B;P<0.05)。因II期和III期結(jié)直腸癌患者易早期發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移[17]，我們進(jìn)一步在這部分患者中分析Rce1表達(dá)對(duì)預(yù)后有無(wú)影響，結(jié)果顯示低表達(dá)Rce1的患者易復(fù)發(fā)且總體生存期較短(圖2C和D;P<0.05)。將對(duì)結(jié)直腸癌患者預(yù)后有影響的病理參數(shù)與Rce1進(jìn)行Cox多因素分析。結(jié)果顯示Rce1可作為結(jié)直腸癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2；P<0.05)。

A、RCE1 在癌旁正常組織中的表達(dá)；B、RCE1在結(jié)直腸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)；C、RCE1在結(jié)直腸癌組織中的陰性表達(dá)； D、條形圖顯示匹配癌旁組織中RCE1的表達(dá)率明顯高于癌組織 (P<0.05)

圖1 RCE1在結(jié)直腸癌組織及匹配癌旁組織中的表達(dá)情況

(A)總體生存率；(B) 無(wú)瘤生存期；(C)II III期患者總體生存率；(D) II III期患者無(wú)瘤生存率

2.3 Rce1與結(jié)直腸癌患者臨床病理參數(shù)分析

從表1中可以看出Rce1表達(dá)差異與血液中癌胚抗原(CEA)表達(dá)水平、腫瘤浸潤(rùn)深度、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期明顯相關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與患者性別、年齡、腫瘤分化、糖鏈抗原19-9(CAA9-9)等無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)。腫瘤組織中Rce1低表達(dá)是結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良因素之一，Rce1可能通過(guò)腫瘤的侵襲性引起患者的不良預(yù)后。

3 討論

目前臨床TNM腫瘤分期系統(tǒng)是結(jié)直腸癌患者選擇治療方式及判斷預(yù)后的主要依據(jù)。雖然根據(jù)UICC的TNM分期系統(tǒng)可以使治療規(guī)范化并評(píng)估患者的預(yù)后，但相同分期的腫瘤患者的預(yù)后仍不盡相同[6, 18]。尤其是II和III期的患者，相當(dāng)一部分術(shù)后患者無(wú)法從化療中獲得收益[19]。近期研究表明，結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制與腫瘤患者的治療療效和預(yù)后相關(guān)[20]，因此尋找到于此相關(guān)的特異性腫瘤標(biāo)志物有助于患者的精細(xì)化治療。

表2 影響237例結(jié)直腸癌患者術(shù)后無(wú)病生存期和總體生存期的多因素分析

Ras-concerting enzyme 1 (Rce1)為金屬蛋白酶家族成員之一。Rce1的主要作用是參與水解末端為CAAX結(jié)構(gòu)的蛋白，如Ras家族蛋白、核纖層蛋白、和一些磷酸化酶與激酶等。這些蛋白參與了細(xì)胞的增殖、分化和腫瘤形成[21]。而RAS蛋白作為典型的含CAAX結(jié)構(gòu)的蛋白，在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[22]。不斷的有研究證明，結(jié)直腸腺瘤向結(jié)直腸癌的進(jìn)展轉(zhuǎn)變通常伴隨RAS基因的持續(xù)激活[6]。且RAS突變的結(jié)直腸癌患者對(duì)抑制表皮生長(zhǎng)因子的單克隆抗體治療效果差，使得單藥之傲的有效率從20%降至0%[23]。近年來(lái)隨著對(duì)Ras蛋白的深入了解，發(fā)現(xiàn)RAS正確定位于細(xì)胞內(nèi)膜這一過(guò)程是行使其生物學(xué)功能的關(guān)鍵，Rce1蛋白是這一過(guò)程中重要的酶[24]。首先，RAS蛋白的法尼基或香葉基脂半胱胺酸殘基的硫醇開(kāi)始異戊烯化。隨后，蛋白質(zhì)的最后三個(gè)氨基酸(即-AXX)被定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的Rce1水解酶特異性內(nèi)切蛋白酶切除。最后，異戊烯半胱氨酸新暴露的羧基端被戊烯半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(ICMT)甲基化因此。RAS蛋白經(jīng)過(guò)這三步驟處理過(guò)程后才能激活下游信號(hào)傳導(dǎo)通路[25]。這一發(fā)現(xiàn)為靶向藥物的研究帶了曙光，其中代表是法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑的研究，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑有效抑制了Ras蛋白活性，但臨床應(yīng)用尚未得到證實(shí)[26]。Rce1也是一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)，但目前對(duì)其研究和認(rèn)識(shí)尚少，需要進(jìn)一步深入研究。Rce1在結(jié)直腸癌中的作用機(jī)制尚未清楚，探討Rce1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其意義對(duì)臨床診療具有一定意義。

本研究通過(guò)免疫組化的方法檢測(cè)Rce1蛋白在結(jié)直腸癌組織及匹配癌旁正常組織中的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Rce1蛋白在癌組織中的表達(dá)明顯低于癌旁組織。進(jìn)一步的Kaplan-Meier生存分析及Cox分享回歸顯示低表達(dá)Rce1是結(jié)直腸癌預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，因部分II期和III期結(jié)直腸癌患者易早期發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移[6]，進(jìn)一步的生存分析結(jié)果顯示低表達(dá)Rce1的患者預(yù)后不良。Rce1協(xié)同TNM分期系統(tǒng)有利于結(jié)直腸癌患者的個(gè)體化治療。為了探討Rce1可能通過(guò)何種途徑影響患者的生存預(yù)后，我們分析了Rce1表達(dá)情況與病人臨床病理參數(shù)的關(guān)系。Rce1低表達(dá)與患者的腫瘤浸潤(rùn)深度、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，結(jié)果提示Rce1可能與腫瘤細(xì)胞的侵襲相關(guān)。但其中的分子機(jī)制需進(jìn)一步研究[27-28]。綜上所述，低表達(dá)Rce1是結(jié)直腸癌預(yù)后不良的指標(biāo)，可更好協(xié)同TNM分期系統(tǒng)來(lái)協(xié)助臨床診療工作。