劉兆宇 姚文霞 梁 雪

蛞蝓，又名蜒蚰、托胎蟲、蛞蝸、鼻涕蟲，是最早收載于《本草綱目》的民間用于治療肺氣腫的傳統(tǒng)中藥，隸屬于軟體動物門中的腹足綱肺螺亞綱，治療喘息、喉痹等。高突足襞蛞蝓是蛞蝓品種之一，在我國主要分布南方亞熱帶及沿海地區(qū)，據(jù)載尤以廣西百色地區(qū)的質量最佳。據(jù)《本草綱目》等記載蛞蝓可用于治療喘息、喉痹、癰腫等，現(xiàn)代醫(yī)學證實其具有降低支氣管炎[1]、哮喘[2]、過敏[3]、肺氣腫[4]等作用。前期已有報道具有多糖和蛋白特征的高突足襞蛞蝓水提物能通過減少氣道粘蛋白表達、減少巨噬細胞侵潤等改善COPD小鼠氣道炎癥[5]。本實驗進一步采用高效液相色譜(HPLC)、凝膠滲透色譜(GPC)、氣相色譜-質譜對蛞蝓提取物多糖的具體單糖組成、相對分子量大小及相應的抗氧化活性進行研究，為進一步研究蛞蝓藥理活性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

DMEM高糖培養(yǎng)基(GIBCO)；胎牛血清(GIBCO)；青-鏈霉素雙抗(吉諾生物)；SOD活力檢測試劑盒(南京建成，A001-3)；CellROX?熒光探針(Thermo, C10443)；葡聚糖標準品(Sigma)；超純水制備機(MILLIPORE)；養(yǎng)生破壁萃取機(佛山益爾康)；高速冷凍離心機(BECKMAN COULTER)；冷凍干燥機(VirTis)；高效液相色譜儀(Agilent 1260 Infinity，美國安捷倫公司)；色譜柱：TOSOH TSK gel G4000SWXL(300 mm×7.8 mm,10 μm)，TOSOH TSK gel G3000SWXL(300 mm×7.8 mm,5 μm)串聯(lián)；熒光導致顯微鏡(Leica, DMi8)。

1.2 實驗方法

1.2.1 高突足襞蛞蝓受試物的提取 新鮮速凍蛞蝓全蟲1 kg解凍，清洗去除其中的泥沙、雜草等，稍稍控干，用養(yǎng)生破壁萃取機攪碎，2000 r/min低溫離心10 min，收集上清液，殘渣加ddH2O反復如上操作，最后合并上清液，使終體積為4 L。將最終得到的提取液4℃靜置過夜，除脂，冷凍干燥24～48 h，得淡黃色粉末。

1.2.2 受試物的提取放大試驗 為檢驗高突足襞蛞蝓受試物提取工藝的穩(wěn)定性，按2.1中完整提取工藝，中試三批樣品。采用苯酚-硫酸法進行多糖定量、采用BCA法進行蛋白定量測定。

1.2.3 高突足襞蛞蝓受試物脫蛋白處理 制備高突足襞蛞蝓受試物1 mg/mL，向溶液中加入Sevage 試劑(氯仿 ∶正丁醇 =4 ∶1，V/V)200 ml，于水平振蕩器中振蕩30 min，以4 000 r/min 的速度離心15 min，收集上層水相，重復4次。將得到的溶液凍干，即得蛞蝓脫蛋白受試物。

1.2.4 高突足襞蛞蝓受試物多糖含量、分子量分布及單糖組成的測定 本部分實驗委托中國廣州分析測試中心進行檢測。分別采用氣相色譜-質譜(GC-M S)、高效液相色譜(HPLC)分析高突足襞蛞蝓受試物多糖的單糖組成，用凝膠滲透色譜(GPC)分析高突足襞蛞蝓受試物多糖的相對分子量及其分布[6]。

1.2.5 煙草提取物的制備及上皮細胞培養(yǎng) 煙草提取物臨用前提取配制。在兩個串聯(lián)的大包氏管內各加入5 mL基礎DMEM高糖培養(yǎng)基，然后在串聯(lián)管的起始端濾頭上連接一根剝掉濾嘴的卷煙，在串聯(lián)管的末端連接一個 50 mL的注射針筒。點燃卷煙后，使用注射針筒以50 mL/10 s的速度抽吸，使煙霧溶于培養(yǎng)基形成氣溶膠，每次 2支卷煙，每支卷煙用注射器抽吸 10次。收集培養(yǎng)基，調節(jié)其PH值為 7.4，使用 0.22 μm 濾器過濾除菌，得到100%的CSE原液，實驗時按需求稀釋成不同濃度 CSE。

16HBE細胞用含10%FBS、1%青-鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，待生長至80～90%匯合鋪板。細胞實驗用相應蛞蝓受試物按照1 mg/mL的濃度用基礎DMEM高糖培養(yǎng)基制備，渦旋混合均勻，0.22 μm 濾器過濾除菌，然后分別以1 μg/mL、2 μg/mL、4 μg/mL對16 HBE細胞進行預處理，1%CSE暴露刺激16HBE細胞24 h，誘導氧化應激損傷。

1.2.6 CSE誘導上皮細胞氧化應激及指標檢測 采用1%CSE暴露刺激16HBE細胞24 h，誘導上皮細胞氧化應激。分別設置陰性對照處理組(DMEM)、受試物處理對照組1(蛞蝓受試物)、受試物處理對照組2(蛞蝓脫蛋白受試物)、模型處理組(CSE)、模型+受試物處理組1(CSE+蛞蝓受試物)、模型+受試物處理組2(CSE+蛞蝓脫蛋白受試物)，在給予CSE的同時各組給予相應處理。收上清，酶標法檢測超氧化物歧化酶(SOD)活力；細胞加入終濃度為5 μm的CellROX?熒光探針，37 ℃孵育30 min，PBS洗3遍，熒光倒置顯微鏡40倍鏡下觀察胞質ROS水平。

2 結果與分析

2.1 高突足襞蛞蝓提取物制備及工藝穩(wěn)定性考察

高突足襞蛞蝓提取物制備流程如圖1所示，500 g高突足襞蛞蝓約得到提取物24 g，產率約為6%。接著模擬工業(yè)化生產的條件下進行工藝考察，以驗證放大生產后原工藝的可行性，保證批次間提取物的質量一致性。結果表明：3批中試樣品，成品提率基本一致，多糖提率和蛋白提率基本一致，且批次間標準偏差約4%，確定本品的提取工藝經放大可行，同時比較穩(wěn)定(見表1)。

圖1 高突足襞蛞蝓提取工藝流程

活蝓量/kg成品性狀成品量(g)得率(%)多糖量(g)多糖率(%)蛋白量(g)蛋白率(%)150淡黃色9 0606.042 0101.342 5601.71150淡黃色8 9305.952 0101.382 6901.70156淡黃色9 5005.942 2601.412 8301.77

2.2 高突足襞蛞蝓提取物的多糖特征及單糖組成

分別采用氣相色譜-質譜(GC-MS)、高效液相色譜(HPLC)分析提取物多糖的單糖組成，結果表明：高突足襞蛞蝓受試物主要含有半乳糖(57.53%)、葡萄糖(17.28%)、甘露糖(9.75%)、果糖(7.12%)、阿拉伯糖(3.44%)、核糖(2.64%)、鼠李糖(2.25%)。脫蛋白處理前后，單糖組成一致(見表2)。采用凝膠滲透色譜(GPC)分析高突足襞蛞蝓相對分子量M r 及其分布，結果表明：蛞蝓受試物多糖的GPC峰的數(shù)均相對分子質量(M n) 為1.33×104，重均分子量(Mw)為3.90×105；蛞蝓脫蛋白受試物多糖的GPC 峰的M n 為4.57×103，重均分子量(Mw)為1.40×104。經脫蛋白處理，高突足襞蛞蝓的分子量分布寬度顯著減少(見圖2，圖3)。

表2 高突足襞蛞蝓脫蛋白前后多糖單糖組成特征

圖2 高突足襞蛞蝓脫蛋白前后多糖GPC峰圖

組成分子量(Molecular weight)數(shù)均分子量(Mn)重均分子量(Mw)分布寬(D)高突足襞蛞蝓受試物1.33×1043.90×10529.4高突足襞蛞蝓脫蛋白受試物4.57×1031.40×1043.06

2.3 高突足襞蛞蝓受試物改善CSE誘導的上皮細胞氧化應激

ROS是氧化應激條件下細胞產生的活性氧，直接反應了細胞氧化應激水平；SOD對細胞抗氧化功能起著至關重要的作用，其活性直接反應細胞的抗氧化能力。結果表明，與對照組相比，CSE暴露可誘導16HBE細胞ROS表達增強，SOD水平顯著降低；與模型組相比，經高突足襞蛞蝓受試物及高突足襞蛞蝓脫蛋白受試物處理后，16HBE細胞的ROS表達明顯降低，相應的SOD水平顯著增加(見圖3、圖4)。

3 討論

氧化應激損傷是目前認為的慢性阻塞性肺疾病(COPD)的發(fā)病機制之一。煙草煙霧常見室內污染物之一，是由上千種化學物質組成的復雜混合物，煙草煙霧暴露能夠引起機體呼吸道氧化損傷[7-8]，而氣道上皮細胞是組成機體氣道屏障的第一防線，會首先出現(xiàn)氧化應激損傷[9]。關于煙草煙霧暴露誘導氣道上皮細胞的氧化應激信號通路激活已有報道[10]，正常情況下機體保持自由基生成和清除的動態(tài)平衡狀態(tài)，煙草煙霧暴露會打破這個動態(tài)平衡，激活氣道上皮細胞產生大量活性氧自由基ROS，機體抗氧化能力(如SOD酶活力)降低，同時引發(fā)氧化應激損傷[11-14]。已有報道雙線嗜粘液蛞蝓多糖具有抗氧化活性[15]，因此本研究采用煙草煙霧提取物CSE暴露處理16HBE，模擬吸煙所致的氣道上皮氧化應激，通過ROS、SOD指標觀察高突足襞蛞蝓提取物中多糖組分的抗氧化效果。中藥提取物的質量控制是中藥藥效研究的重要影響因素[16-17]，本研究以多糖和蛋白為主要質量評價指標，通過擴大實驗證實高突足襞蛞蝓水提物的提取工藝穩(wěn)定性，以確保后續(xù)實驗所用受試樣品質量具有較好的一致性，同時也證實了受試物制備工藝穩(wěn)定性較好，經放大實驗仍然能保證受試樣品批次間產率無統(tǒng)計學差異，也為后續(xù)體外實驗奠定了基礎。多糖通常是由多種單糖組成，而單糖組成與體外的抗氧化活性有較強的相關性[18]。通過分析高突足襞蛞蝓受試物及高突足襞蛞蝓脫蛋白受試物中多糖的單糖組成、相對分子質量及其分布，發(fā)現(xiàn)高突足襞蛞蝓受試物經脫蛋白處理前后，單糖的基本組成并無改變，二者相應的抗氧化效果也較為接近。但是經脫蛋白處理前后的兩種足襞蛞蝓受試物，其單糖組成比例有所改變，受試物中關鍵單糖的所占比例改變，使得原有的改善SOD酶活力的效果更加明顯而不依賴于“劑量-效應”關系，因此如果能進一步找到足襞蛞蝓天然多糖組成的關鍵單糖，勢必能夠為提高足襞蛞蝓的抗氧化效果提供實驗依據(jù)。經脫蛋白處理后，受試物的相對分子質量明顯變小、分布寬明顯變窄提示脫蛋白處理對高突足襞蛞蝓中的多糖含量有一定影響，推測足襞蛞蝓多糖天然狀態(tài)下可能是與蛋白形成復合結構，因此會受到化學法脫蛋白過程的影響。這與先前報道的雙線嗜粘液蛞蝓具有多糖肽鏈結構較為一致[15]。而足襞蛞蝓脫蛋白受試物的抗氧化效果并未受到化學法脫蛋白過程的影響，反而提高了低劑量受試物的SOD酶活力，提示足襞蛞蝓受試物中抗CSE誘導的氣道上皮細胞氧化應激的主要組分是其中的多糖。COPD是一種氣道慢性非特異性炎癥引發(fā)的呼吸疾病，氣道的上皮屏障損傷、炎癥細胞持續(xù)浸潤都是引起呼吸道損傷重塑進而導致肺氣腫的關鍵機制[19-20]。本研究中，我們通過觀察足襞蛞蝓提取物多糖對氣道上皮屏障抗氧化應激的效果，揭示足襞蛞蝓在COPD肺氣腫形成初期可能存在潛在的預防保護作用。然而天然多糖具有多種生物學功能，參與細胞生物信息傳遞、調節(jié)機體免疫等[21]。因此，除了抗氧化應激外，足襞蛞蝓提取物多糖是否同時兼具調節(jié)免疫作用，抑制肺部及氣道炎癥，后續(xù)還需要進一步研究。

圖3 高突足襞蛞蝓受試物及高突足襞蛞蝓脫蛋白受試物處理改善CSE誘導的SOD活性降低

圖4 高突足襞蛞蝓受試物及高突足襞蛞蝓脫蛋白受試物處理降低CSE誘導的ROS增加

綜上所述，高突足襞蛞蝓的多糖數(shù)均相對分子質量(M n) 為1.33×104，重均分子量(Mw)為3.90×105，主要由半乳糖、葡萄糖、甘露糖、果糖、阿拉伯糖、核糖、鼠李糖組成。經脫蛋白處理后，相對分子質量降低，但是單糖組成比例基本不變。高突足襞蛞蝓能降低CSE刺激人氣道上皮細胞引起的ROS釋放，同時增強SOD酶活力，初步判斷其抗氧化組分主要為其中的多糖組分。針對確切的抗氧化應激組分，還需要進一步研究分析。