馬 蓉 劉 建 肖曉秋

1.新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院 (烏魯木齊，830000)；2.重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院；3.重慶醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院

妊娠期糖尿病(GDM)患者大多存在脂代謝紊亂，高脂血癥以及促炎性因子分泌增加等是導致胰島素敏感性下降的共同機制。糖皮質激素在妊娠后期胎兒成熟、器官發(fā)育中起重要調節(jié)作用[1]。研究提示：胎盤絨毛組織中存在調節(jié)糖皮質激素代謝的屏障分子11β-羥類固醇脫氫酶(11β-HSDs)。有研究發(fā)現(xiàn)，GDM患者胎盤11β-HSD1 mRNA 的表達降低，而11β-HSD2 mRNA 提高， 11β-HSD1蛋白表達水平降低，而11β-HSD2蛋白水平未見變化[2]。 GDM患者多伴有高胰島素、高皮質醇血癥[2]，在這些合并癥的影響下胎盤組織中11β-HSDs表達出現(xiàn)變化。地塞米松廣泛應用在糖尿病治療中，胎盤組織的體外孵育技術已成熟，可通過地塞米松來檢測胎盤組織氧化應激水平[3-4]。本研究參照有關方法，對胎盤組織進行體外超生理濃度孵育，分別利用游離脂肪酸、地塞米松、胰島素以及三者的混合物進行刺激[5]，在保證胎盤組織活力不受影響下，觀察對胎盤組織11β-HSDs表達影響，探討GDM患者胎盤組織中差異變化的可能原因。

1 材料和方法

1.1 標本收集

收集在本院剖宮產分娩(社會因素剖宮產)的糖代謝正常孕婦胎盤組織(經孕婦同意并簽署知情同意書)。剖宮產術后將娩出胎盤消毒處理后，沿臍帶根部在胎盤母面中央選取一定尺度的胎盤(避開鈣化部位)，磷酸鹽緩沖液沖洗3次后分割成相等大小塊樣本，分別放入基礎溶液(BASA組)、0.4mM游離脂肪酸(PA組)、0.3μM地塞米松(DEX組)、0.01μM胰島素(INS組)、PA+DEX+Insulin混合液(MIX組)等溶液中(各溶液濃度參照預實驗及保證胎盤組織活性設定)，置于37℃恒濕培養(yǎng)箱中孵育24h后取出，提取樣本組織總RNA 和總蛋白。本研究通過重慶醫(yī)科大學生物倫理委員會審批，中國臨床實驗注冊。

1.2 實驗方法

1.2.1引物合成蘇州科德萊生物試劑有限公司合成，引物序列為：11β-HSD1引物序列(5’-AAGTTGCAGTGAGCCGAGATC-3’5’-TTCCGAGGCAGAGTCTTGCT-3’,AY044083),11β-HSD2引物序列(5’-GGCCAAGGTTTCCCAGTGA-3’,5’-GAGGGTGTTTGGGCTCATGA-3’,NM000196)

1.2.2總RNA提取取胎盤組織100mg加入1ml Trizol后提取胎盤組織總RNA；取2ug RNA進行逆轉錄反應，反應體系20ul。

1.2.3基因表達測定cDNA稀釋10倍后，取2ul與SYBR premix Ex Taq Ⅱ 及引物進行實時熒光定量PCR法多聚合酶鏈反應，擴增體系10μl。擴增條件：95℃ 3min,95℃ 變性10 s,退火60℃ 30s,延伸65℃ 5s,循環(huán) 39 次。溶解曲線在 65℃-95℃， β-actin來標準化mRNA的表達，對所得產物通過溶解曲線評價其特異性，實時定量PCR的結果用2-△△Ct計算。

1.2.4 11β-HSD蛋白表達檢測①各組分別取80mg胎盤組織用裂解液充分勻漿處理后， 4℃下高速離心取上清蛋白。②用BCA蛋白定量試劑盒進行定量，取80μg蛋白加5×上樣緩沖液100℃煮沸10min，行SDS-PAGE電泳，結束之后轉入到硝酸纖維素膜上， 5%牛奶室溫焊接下封閉處理1h，用稀釋×1000倍的一抗(兩種脫氫酶抗體)室溫環(huán)境下孵育1h后在4℃放置12h；TBST漂洗；按×3000倍比例稀稀釋二抗，進行同樣孵育處理。③顯影,ECL發(fā)光液A和B等體積混勻。④洗膜，顯影結束之后，全溫搖床50℃洗膜 18min,按照同樣的步驟孵育兔多克隆一抗，二抗使用HRP標記的山羊抗兔IgG，二者稀釋比例同前。顯影。質量分析軟件分析和灰度比值，據(jù)此評定二者的蛋白相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 孵育介質中LDH活性

與BASA組相比，各組孵育介質中的LDH活力不存在差異(P>0.05)，LDH 活力降低幅度<5%,孵育未對組織活性產生明顯影響。見圖1。

圖1 不同處理組孵育介質中的LDH活性

2.2 各組胎盤組織中11β-HSD基因表達

PCR 結果提示，各溶液組11β-HSD1基因表達均低于BASA組， 而11β-HSD2基因表達均高于BASA組(均P<0.05)，見表1。

2.3 各組胎盤組織11β-HSD 蛋白水平表達

胎盤組織中11β-HSD1蛋白表達BASA組最高，各組分別為0.99±0.01、0.43±0.05、0.18±0.02、0.71±0.09、0.54±0.06(P<0.05)，見圖2；11β-HSD2蛋白表達BASA組最低，各組分別為1.04±0.04、2.27±0.16、4.10±0.98、3.10±0.39、3.98±0.32(P<0.05)，見圖3。

表1 各組胎盤組織11β-HSD基因水平表達

*均與BASA組比較P<0.05

圖2 胎盤組織經不同處理孵育后11β-HSD1蛋白水平表達

圖3 胎盤組織經不同處理孵育后11β-HSD2蛋白水平表達

3 討論

糖皮質激素可作用于許多靶組織發(fā)揮重要生理作用。有研究發(fā)現(xiàn)GDM患者常伴隨有一定的胰島素敏感性降低等相關特征[6]，脂代謝異常的孕婦血清瘦素水平有一定降低，產生胰島素抵抗的風險提高[10]。糖皮質素激素可通過干擾胰島素受體而起到抵抗胰島素作用[7]。研究表明GDM患者易出現(xiàn)高皮質醇血癥，而臍血皮質醇沒有明顯變化，可能與糖皮質激素分子的屏障作用有關。研究證實[8-9]妊娠期間胎盤組織中存在著調節(jié)糖皮質激素的生理屏障—11β-HSDs，該酶有11β-HSD1和11β-HSD2兩種同工酶，11β-HSD1在還原作用下使無活性的皮質酮被激活，提高糖皮質激素作用；11β-HSD2在氧化作用下促使有活性的皮質醇被還原而失活。

在GDM病理妊娠過程中11β-HSD1的基因和蛋白表達量降低，可能減小了對糖皮質激素的影響作用；11β-HSD2的基因表達量和蛋白水平提高可能增加了對糖皮質激素的滅活作用。相關研究發(fā)現(xiàn)很多內源性的刺激如缺氧、孕激素、雌激素等都可以對胎盤組織中該酶的表達起一定調節(jié)作用。而糖皮質激素也可以影響這種同工酶的表達[10]。類似的地塞米松也對 11β-HSD2基因的表達起到一定的調節(jié)作用[11]。本研究在不影響胎盤組織活性情況下選擇不同配制的溶液進行觀察，各溶液組胎盤組織的11β-HSD1基因和蛋白水平表達均下調，11β-HSD2基因和蛋白水平表達則上調。驗證了GDM發(fā)生時胎盤組織中11β-HSDs 的代償性變化， GDM時高脂血癥、高皮質醇血癥、高胰島素血癥是引起 11β-HSDs 調控變化的主要分子機理，但調節(jié)通路還不明確，需進一步研究。