侯曉鴻, 寧 娜, 李 楊, 何金玲, 燕 子, 原 媛, 王 麗△, 王曉暉△
(山西醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院 1病理教研室, 2生理學系, 3形態(tài)學實驗室, 山西 太原 030001)
心功能不全是各種病因所致心血管疾病的終末階段,其病因復雜,死亡率高,已成為發(fā)達國家和發(fā)展中國家的重大公共衛(wèi)生問題[1],但發(fā)病機制尚未完全闡明。大量研究表明,心功能不全的發(fā)生發(fā)展過程中存在心肌細胞凋亡[2],并且心肌細胞凋亡對心肌結構和功能的調節(jié)起著至關重要的作用,因此抑制心肌細胞凋亡可以有效防止和緩解心功能不全[3]。
近年來研究顯示,在40%~60%心功能不全患者血清中均可檢測到β1-腎上腺素受體自身抗體(β1-adrenoceptor autoantibody,β1-AA)[4],進一步研究發(fā)現(xiàn),β1-AA可以與β1-腎上腺素受體(β1-adrenoceptor,β1-AR)特異性結合,誘導心肌細胞凋亡[5]。然而,β1-AA如何誘導心肌細胞凋亡目前尚不清楚。
內(nèi)質網(wǎng)在氧化應激、維持鈣穩(wěn)態(tài)和觸發(fā)細胞凋亡信號等多種細胞過程中發(fā)揮重要作用[6]。當內(nèi)質網(wǎng)穩(wěn)態(tài)因各種因素被打破,就會引起內(nèi)質網(wǎng)應激。輕度和短暫的內(nèi)質網(wǎng)應激是細胞的一種自我保護機制,而持續(xù)嚴重的內(nèi)質網(wǎng)應激,會誘發(fā)心肌細胞凋亡[7]。然而,內(nèi)質網(wǎng)應激在β1-AA誘導的心肌細胞凋亡過程中是否發(fā)揮作用目前尚不清楚。本研究將通過在體和離體實驗,探討內(nèi)質網(wǎng)應激在β1-AA誘導的心肌細胞凋亡中的作用,為闡明β1-AA誘導心肌細胞凋亡的機制提供新的理論支持。
8周齡雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠,體重180~200 g,由山西醫(yī)科大學動物中心提供,合格證編號為SCXK(晉)2015-001。將大鼠置于恒定環(huán)境,室溫(22±2) ℃、濕度35%~55%,自由飲食。本研究中涉及動物的所有程序均得到山西醫(yī)科大學倫理委員會批準,使用過程符合國家實驗動物使用規(guī)定。H9c2心肌細胞系購買自中國科學院上海細胞庫。
β1-AR細胞外第二環(huán)(the second extracellular loop of β1-AR,β1-AR-ECII)抗原肽段由吉爾生化上海有限公司合成;完全弗氏佐劑(complete Freund’s adjuvant, CFA)、不完全弗氏佐劑(incomplete Freund’s adjuvant, IFA)、2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS)和4-苯基丁酸(4-phenoxybutyric acid,4-PBA)均購自Sigma;DMEM培養(yǎng)基和BCA試劑盒購自Thermo Fisher Scientific;抗葡萄糖調節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein 78,GRP78)、C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein, CHOP)和caspase-12抗體均購自Abcam;抗GAPDH抗體及 II 抗購自中杉金橋;0.45 μm PVDF膜購自Whatman;SuperECL Plus超敏發(fā)光液購自普利萊;SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購自索萊寶;胎牛血清購自Excell;CCK-8試劑盒購置同仁化學。
3.1主動免疫大鼠 選取8周齡雄性SD大鼠,隨機分為2組:免疫(β1-AA)組和溶劑對照(vehicle)組,將β1-AR-ECII抗原肽段溶解稀釋,并和完全弗氏佐劑1 ∶1混勻后,采用多點背部皮下注射(0.4 μg/g)即首次免疫;以后每隔2周加強免疫1次,并加入不完全弗氏佐劑1 ∶1乳化抗原,共免疫8周;溶劑對照組用等量Na2CO3溶液替代抗原溶液,實驗方案同免疫組。
3.2鏈霉親和素-酶聯(lián)免疫吸附實驗(SA-ELISA)檢測血清中β1-AA水平 將合成的β1-AR-ECII(10 mg/L)包被空白ELISA板,4 ℃過夜;磷酸鹽緩沖液封閉ELISA 板;將陽性對照、空白對照及待測血清稀釋后加于ELISA板,加帶有生物素標記的 II 抗及帶有辣根酶標記的鏈霉卵白素于ELISA板,以上各步分別在37 ℃水浴1 h;底物顯色30 min;最后測定吸光度(A)值。計算P/N判定結果,P/N=(標本A值-空白對照A值)/(陰性對照A值-空白對照A值),P/N≥2.1 定為抗體陽性,P/N≤1.5 為陰性。
3.3親和層析法提純β1-AA 采用親和層析法提純主動免疫大鼠血清中的β1-AA,應用于離體實驗研究。從4 ℃取出層析柱放置室溫30 min,將三蒸水注入層析柱內(nèi)部,沖去保存在柱子中的乙醇;用結合緩沖液沖洗柱子后,抽取含有β1-AA的血清濾過柱子并用洗脫緩沖液沖洗柱子,使β1-AA隨同洗脫緩沖液滴到EP管中;用BCA試劑盒進行蛋白定量。
3.4Western blot檢測心肌組織中GRP78、CHOP和caspase-12的蛋白表達 提取大鼠心肌組織蛋白,用BCA試劑盒進行蛋白定量。上樣并進行SDS-PAGE分離以及用PVDF膜轉膜,5%的脫脂奶粉封閉,與Ⅰ抗稀釋液進行反應,4 ℃過夜;次日加II抗反應2 h;將膜置于全自動曝光儀內(nèi),曝光拍攝條帶,ImageJ軟件分析灰度值,將GAPDH作為內(nèi)參照,計算不同蛋白的相對表達量。
3.5TUNEL染色檢測心肌組織的凋亡水平 取大鼠心肌組織制備切片,脫蠟和水化;用蛋白酶K通透細胞;制備TUNEL反應混合物并標記反應;DAB顯色;蘇木素復染,封片,顯微鏡下拍照,Image-Pro Plus 6.0 圖像分析軟件進行凋亡細胞計數(shù)。心肌細胞凋亡率即凋亡指數(shù)(apoptotic index,AI;%)=凋亡心肌細胞核數(shù)/心肌細胞核總數(shù)×100%。
3.6免疫組化法檢測心肌組織中GRP78、CHOP及caspase-12的蛋白原位表達 選取大鼠心肌組織浸入福爾馬林固定;隨后石蠟包埋,切片,二甲苯脫蠟至水;H2O2避光處理及抗原修復;用血清室溫封閉;與Ⅰ抗稀釋液反應,4 ℃過夜;次日加相應II抗37 ℃孵育20 min; 顯色,復染,脫水,透明,然后封片。在顯微鏡下觀察拍照分析。
3.7細胞培養(yǎng)及處理 用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基加入1%青鏈霉素混合液用于H9c2細胞的培養(yǎng),將培養(yǎng)瓶置于含5% CO2、37 ℃及飽和濕度的恒溫細胞培養(yǎng)箱中,隔天傳代。根據(jù)具體情況更換新的培養(yǎng)基,加入1 μmol/L的β1-AA進行處理,分別在12 h、24 h和36 h收集樣本。
3.9Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術檢測心肌細胞的凋亡水平 向6孔板中加入細胞懸液(每孔1 mL),待細胞貼壁后,實驗組1 mmol/L 4-PBA預處理2 h,再加1 μmol/L β1-AA處理細胞6 h,收集樣本加凋亡試劑,用流式細胞術檢測并分析細胞凋亡水平。
采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。結果以均數(shù)±標準誤(mean±SEM)表示,多組間比較采用單因素方差分析,流式細胞術結果組間兩兩比較采用SNK-q檢驗,其它結果組間兩兩比較采用LSD-t檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
SA-ELISA結果顯示,隨著主動免疫時間的延長,對照組大鼠血清中β1-AA的水平無明顯變化,而主動免疫2周后大鼠血清中β1-AA的水平與對照組相比顯著增加(P<0.01),持續(xù)增加至8周(P<0.01),提示主動免疫大鼠模型建立成功,見圖1。
Figure 1.The A value of β1-AA increased in the serum of adult rats in the active immunization model with synthetic peptide. Mean±SEM. n=15. * P<0.05, ** P<0.01 vs vehicle group.
TUNEL染色后,凋亡細胞的細胞核呈現(xiàn)棕黃色,正常細胞的細胞核呈現(xiàn)藍色。在本研究中,對照組心肌組織可見少量棕黃色細胞核,即存在少量凋亡細胞,而β1-AA主動免疫2周時心肌組織中TUNEL染色陽性即棕黃色的細胞核明顯增多,一直持續(xù)至主動免疫8周(P<0.01),見圖2。以上結果提示β1-AA長期存在可以引起心肌細胞凋亡增加。
Western blot結果顯示,與對照組相比,GRP78、CHOP和caspase-12的蛋白表達水平在β1-AA主動免疫4周時開始出現(xiàn)明顯增加,β1-AA主動免疫8周時,GRP78、CHOP和caspase-12的蛋白表達水平進一步增加(P<0.01),見圖3A。免疫組化結果顯示,與對照組相比,心肌組織GRP78、CHOP及caspase-12的蛋白表達在主動免疫4周明顯增加,持續(xù)增加至8周(P<0.05),與Western blot結果一致,見圖3B。以上結果均提示β1-AA長期存在可以誘導內(nèi)質網(wǎng)應激及其相關凋亡通路激活。
結果顯示,與對照組相比,β1-AA干預H9c2心肌細胞12 h細胞活力開始顯著降低,36 h達最低,β1-AA干預48 h心肌細胞活力持續(xù)降低(P<0.01),見圖4。這提示β1-AA可以引起H9c2心肌細胞活力顯著下降。
Figure 2.The significant rise in cardiomyocyte apoptosis was induced by β1-AA. The scale bar=40 μm. Mean±SEM. n=6. ** P<0.01 vs vehicle group.
流式細胞術結果顯示,與對照組相比,β1-AA干預H9c2心肌細胞6 h細胞的凋亡水平明顯增加(P<0.05),見圖5。這提示β1-AA可以引起H9c2心肌細胞凋亡水平顯著升高。
4-PBA預處理心肌細胞2 h可明顯逆轉β1-AA誘導的心肌細胞活力降低。與β1-AA單獨處理組相比,0.5 mmol/L和1 mmol/L 4-PBA處理H9c2 細胞2 h后,再給予β1-AA干預的心肌細胞可見活力明顯升高(P<0.05),然而,當2.5 mmol/L和5 mmol/L濃度的4-PBA預處理心肌細胞后,與β1-AA單獨處理組相比細胞活力無明顯變化,提示4-PBA在0.5 mmol/L和1 mmol/L濃度可以明顯改善H9c2細胞活力,其中1 mmol/L 4-PBA對于心肌細胞活力的改善最明顯,因此我們選擇1 mmol/L 4-PBA 用于后續(xù)研究,見圖6。Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術檢測結果發(fā)現(xiàn),與β1-AA單獨處理組相比,1 mmol/L 4-PBA預處理H9c2細胞2 h,再給予β1-AA干預,心肌細胞的凋亡水平部分恢復(P<0.05),見圖5。
本研究中,我們建立β1-AA主動免疫大鼠模型,TUNEL結果顯示,主動免疫大鼠心肌組織的凋亡率增加;利用Western blot和免疫組化方法發(fā)現(xiàn)β1-AA可以誘導心肌組織內(nèi)質網(wǎng)應激明顯增強;同時采用親和層析法提純主動免疫大鼠血清中的β1-AA作用于H9c2細胞,結果發(fā)現(xiàn)β1-AA可以顯著降低心肌細胞活力,同時凋亡水平明顯升高。為進一步探討β1-AA誘導的內(nèi)質網(wǎng)應激與凋亡之間的關系,本研究采用4-PBA抑制內(nèi)質網(wǎng)應激,結果發(fā)現(xiàn)抑制內(nèi)質網(wǎng)應激可以有效降低心肌細胞的凋亡,恢復細胞存活率,提示內(nèi)質網(wǎng)應激參與了β1-AA誘導的心肌細胞凋亡。
近年來,我國居民心血管疾病的患病率逐漸增加,心功能不全作為心血管疾病的終末階段,已經(jīng)成為心血管疾病的主要死亡原因。研究表明,在40%~60%心功能不全患者血清中均可檢測到高滴度的β1-AA[4];β1-AA是針對β1-AR-ECII的自身抗體,人鼠同源性高達100%[8]。β1-AA可以與β1-AR結合發(fā)揮類激動劑樣的作用,引起細胞內(nèi)cAMP含量積累,進而影響細胞內(nèi)Ca2+的穩(wěn)態(tài),引起心肌細胞死亡,最終導致心功能不全[9]。我們課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)β1-AA長期存在可以導致大鼠心肌重構和心臟功能受損[10];而采用免疫吸附法去除心功能不全患者血清中的β1-AA可以大大改善心功能不全[11]。由此可見,β1-AA可以造成明顯的心肌損傷,進而引起心功能不全,然而機制不清。
心肌細胞死亡在心功能不全的發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。研究報道,心肌細胞持續(xù)丟失可引起心功能不全,抑制心肌細胞死亡可有效改善心功能[12]。在本實驗中,為了觀察β1-AA對H9c2心肌細胞死亡的影響,我們首先建立β1-AR-ECII主動免疫大鼠模型,腹主動脈采血后,采用親和層析法提純大鼠血清中的β1-AA,用于后續(xù)離體實驗研究。本研究發(fā)現(xiàn),1 μmol/L β1-AA作用于H9c2心肌細胞12 h時可以引起細胞活力明顯降低,36 h細胞活力降至最低,48 h細胞活力持續(xù)降低,提示β1-AA可以誘導心肌細胞死亡。細胞凋亡作為細胞程序性死亡的方式之一,可以維持機體穩(wěn)態(tài),然而,心肌細胞凋亡的持續(xù)存在可以增加心肌細胞死亡,導致心功能不全,采用caspase抑制劑Z-VAD-FMK可以有效抑制心肌細胞的凋亡,進而改善心肌的收縮和舒張功能,提示心肌細胞凋亡在心功能不全中發(fā)揮重要作用[13]。β1-AA
Figure 4.The reduced viability of H9c2 myocardial cells induced by β1-AA. Mean±SEM. n=6. * P<0.05, ** P<0.01 vs vehicle group.
可以激活心肌細胞cAMP依賴的蛋白激酶信號通路,引起caspase-3活化,導致心肌細胞凋亡[14]。本研究發(fā)現(xiàn),β1-AA主動免疫2周時心肌組織中TUNEL染色陽性細胞數(shù)明顯增多,提示心肌組織凋亡明顯增加,同時,β1-AA直接作用于H9c2心肌細胞12 h后凋亡水平顯著增加。但是β1-AA如何誘導心肌細胞凋亡目前尚不十分清楚。
目前認為有3條通路誘導凋亡的發(fā)生:線粒體通路、死亡受體通路和內(nèi)質網(wǎng)通路[15-17]。內(nèi)質網(wǎng)通路是新近發(fā)現(xiàn)的途徑,持續(xù)內(nèi)質網(wǎng)應激可以誘導內(nèi)質網(wǎng)-凋亡途徑,引起細胞凋亡[18]。內(nèi)質網(wǎng)對刺激極為敏感,當各種應激誘導其功能紊亂時,誘導內(nèi)質網(wǎng)應激增強。GRP78是內(nèi)質網(wǎng)應激特異標志分子[19],CHOP,caspase-12已被證明介導內(nèi)質網(wǎng)應激-凋亡相關通路的關鍵分子[20]。因此,本研究選擇GRP78、CHOP和caspase-12來反映內(nèi)質網(wǎng)應激及其相關凋亡通路的變化情況。有研究表明,β1-AR激活可以誘導內(nèi)質網(wǎng)應激增加,引起內(nèi)質網(wǎng)標志蛋白GRP78表達增加,同時發(fā)現(xiàn)CHOP和caspase-12蛋白表達也增加[21]。而使用β-AR拮抗劑美托洛爾可以有效抑制內(nèi)質網(wǎng)應激[22]。那么,β1-AA同樣作為β1-AR的激動劑,是否也會引起心肌細胞內(nèi)質網(wǎng)應激激活呢?在本研究中,我們發(fā)現(xiàn),β1-AA主動免疫大鼠2周時心肌組織GRP78、CHOP和caspase-12的蛋白表達與對照組相比無明顯變化,而β1-AA主動免疫大鼠4周和8周時GRP78、CHOP和caspase- 12的蛋白表達水平明顯升高,提示β1-AA可以誘導內(nèi)質網(wǎng)應激及其相關凋亡通路的激活。
Figure 6.Decreased cell viability induced by β1-AA was partially recovered by endoplasmic reticulum stress inhibitor 4-PBA. The H9c2 myocardial cells was pretreated with 4-PBA (0 mmol/L, 0.5 mmol/L, 1 mmol/L, 2.5 mmol/L and 5 mmol/L) for 2 h before adding β1-AA (1 μmol/L), and CCK-8 assay was performed to measured the cell viability. Mean±SEM. n=9. * P<0.05 vs vehicle group; # P<0.05, ## P<0.01 vs β1-AA group.
內(nèi)質網(wǎng)應激作為細胞凋亡的主要通路之一,其功能的抑制對細胞凋亡具有改善作用。4-PBA是一種化學分子伴侶,穩(wěn)定蛋白質構象,改善內(nèi)質網(wǎng)蛋白質折疊和轉運,緩解內(nèi)質網(wǎng)應激,是內(nèi)質網(wǎng)應激的特異性抑制劑。有研究表明,4-PBA可以抑制內(nèi)質網(wǎng)應激改善心肌細胞的凋亡水平[23]。為了進一步驗證內(nèi)質網(wǎng)應激在β1-AA誘導的心肌細胞凋亡中發(fā)揮何種作用,本研究采用1 mmol/L 4-PBA預處理H9c2心肌細胞后,再加β1-AA干預,通過Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術檢測細胞凋亡情況,結果發(fā)現(xiàn)4-PBA預處理H9c2心肌細胞后可降低β1-AA誘導細胞的凋亡水平,同時,通過CCK-8法檢測細胞的存活率,結果發(fā)現(xiàn)4-PBA的預處理可以有效提高β1-AA誘導H9c2心肌細胞的活力。這些結果提示抑制內(nèi)質網(wǎng)應激可以有效逆轉β1-AA誘導的心肌細胞凋亡。
綜上所述,本研究證實β1-AA的長期持續(xù)存在可以引起心肌細胞活力降低,心肌細胞凋亡水平增加,同時發(fā)現(xiàn)β1-AA誘導內(nèi)質網(wǎng)應激及其相關凋亡途徑激活,采用內(nèi)質網(wǎng)應激抑制劑4-PBA可以有效改善β1-AA誘導的細胞凋亡水平增加和活力下降,提示β1-AA可以通過內(nèi)質網(wǎng)應激誘導心肌細胞凋亡。因此,早期合理調控內(nèi)質網(wǎng)應激,進而調控心肌細胞凋亡,可能有效減少心肌細胞丟失,改善心功能。這為治療β1-AA陽性患者的心功能不全提供新的理論依據(jù)。