王 倩， 徐慶麗， 李艷華， 任興業(yè)

(濟(jì)南市第五人民醫(yī)院婦產(chǎn)科， 山東 濟(jì)南 250022)

宮頸癌是嚴(yán)重影響婦女健康與生命的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率占所有婦科腫瘤的9%和12%[1]。資料顯示，每年全球有近20萬人死于宮頸癌，其發(fā)病人數(shù)和死亡人數(shù)呈逐年增加和年輕化趨勢[2]。根治性子宮切除和局部放射治療是宮頸癌的主要治療方案，但是對于晚期宮頸癌的治療效果仍不理想[3]。研究表明50%的晚期宮頸癌患者對放射治療不敏感，導(dǎo)致預(yù)后不良，進(jìn)而誘發(fā)腫瘤轉(zhuǎn)移[4]。因此，放療抗性是晚期宮頸癌治療失敗的主要原因之一，但其分子機(jī)制仍不清楚。微小RNA(micro-RNAs，miRNAs)是一類長度為18～22個(gè)堿基對組成的非編碼RNA，參與腫瘤的轉(zhuǎn)移，調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等生物學(xué)行為，具有抑癌(miR-15a、miR-29和miR-214)[5-7]或促癌(miR-21、miR-218和miR-193b)[8-9]功能。研究表明，miR-22和miR-181a過表達(dá)能增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞輻射敏感性[11-12]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-1246參與系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)病過程[13]及SV40病毒誘導(dǎo)的支氣管上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化[14]。新近研究表明miR-1246在宮頸癌組織中低表達(dá)，其低表達(dá)與宮頸癌的臨床分期相關(guān)[15]，提示miR-1246是一個(gè)腫瘤相關(guān)因子參與宮頸癌的發(fā)生與發(fā)展。目前miR-1246在宮頸癌細(xì)胞惡性表型中的生物學(xué)功能仍不清楚，其能否調(diào)節(jié)宮頸癌細(xì)胞的放療敏感性，尚無研究報(bào)道。本研究運(yùn)用宮頸癌細(xì)胞系為對象，體外研究miR-1246過表達(dá)的宮頸癌細(xì)胞對輻射敏感性，初步探討miR-1246調(diào)節(jié)宮頸癌細(xì)胞輻射敏感性的分子機(jī)制，為以miR-1246為靶點(diǎn)開發(fā)宮頸癌輻射增敏劑提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料與試劑

取來自濟(jì)南市第五人民醫(yī)院2012-2017年宮頸麟癌組織56例及對照組48例(包括子宮腺肌癥、子宮內(nèi)膜息肉及慢性輸卵管炎組織樣本)。宮頸癌細(xì)胞系HeLa、CaSki、C33A和SiHa購自ATCC；正常子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞系ESC購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所。改良型RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和1%青、鏈霉素購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司；胰酶和MTT購自Sigma；miR-1246模擬物(miR-1246 mimic)和陰性對照模擬物(negative control mimic,NC-mimic)購自廣州銳博生物科技技術(shù)有限公司；microRNA提取試劑盒和Taqman miRNA試劑盒購自Applied Biosystems；脂質(zhì)體2000購自Invitrogen；抗p-ATM、ATM和DYRK1A抗體購自Abcam； γH2AX、p-p53和β-actin抗體購自Cell Signaling Technology；Transwell小室和BCA試劑盒購自Thermo。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) HeLa、CaSki、C33A、SiHa和ESC細(xì)胞均培養(yǎng)在RPMI-1640完全培養(yǎng)基中(含10% FBS、1%青霉素和1%鏈霉素)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2miR-1246表達(dá)水平的檢測 收集正常培養(yǎng)的HeLa、CaSki、C33A、SiHa和ESC細(xì)胞，按照mirVana miRNA分離試劑盒提取細(xì)胞、腫瘤和對照組織miRNA，運(yùn)用TaqMan miRNA檢測試劑盒檢測miR-1246的表達(dá)水平；采用SYBR GreenⅡ熒光染料法和IQ5TMReal-Time PCR Detection System(Bio-Rad)進(jìn)行real-time PCR數(shù)據(jù)分析，miR-1246結(jié)果經(jīng)U6 snRNA校正，相對表達(dá)量用2-ΔΔCt表示，進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。引物序列見表1。

表1 Real-time PCR 引物

2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 HeLa、CaSki、C33A和SiHa細(xì)胞經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化，計(jì)數(shù)后種于6孔板中(每孔2.0×104個(gè))，培養(yǎng)至細(xì)胞密度為60%左右時(shí)按照Lipofectamine 2000說明書將miR-1246 mimic和NC-mimic轉(zhuǎn)染至各細(xì)胞。培養(yǎng)4 h后換成RPMI-1640完全培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.4電離輻射及細(xì)胞活力檢測 按照X射線生物輻照儀說明書進(jìn)行操作，輻射劑量率為0.25 Gy/min，運(yùn)用0.5 mm鋁過濾器對X射線進(jìn)行過濾；將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞經(jīng)10 Gy電離輻射照射后，分別于0 h、24 h、48 h、72 h和96 h檢測細(xì)胞活力，以未輻照細(xì)胞為對照組；每孔加入20 μL MTT(5 g/L)，37 °C培養(yǎng)4 h，棄掉培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，搖床上室溫震蕩5 min，用酶標(biāo)儀測定492 nm處的吸光度(A)值。

2.5細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞經(jīng)10 Gy電離輻射照射后96 h進(jìn)行Transwell實(shí)驗(yàn)，在Transwell每個(gè)培養(yǎng)孔上室中加入1.5×104個(gè)細(xì)胞，下室為無血清培養(yǎng)基，設(shè)置空白對照組；37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)6 h后，經(jīng)4%多聚甲醛固定、乙醇脫水、結(jié)晶紫染色、洗滌。用棉簽輕輕擦去上室的貼壁細(xì)胞，在顯微鏡下拍照并計(jì)數(shù)從Transwell上室遷移至微孔膜下層的細(xì)胞，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，通過每組遷移細(xì)胞數(shù)比較細(xì)胞的遷移能力。

2.6免疫熒光標(biāo)記與觀察 轉(zhuǎn)染的4種宮頸癌細(xì)胞經(jīng)10 Gy電離輻射照射，分別于0 h和2 h進(jìn)行免疫熒光；經(jīng)細(xì)胞爬片，4%多聚甲醛室溫固定15 min，PBS洗滌后經(jīng)0.1% Triton X-100透化10 min, 2% BSA封閉，孵育 I 抗γH2AX(1 ∶100)和II抗AF594，DAPI核染色，共聚焦顯微鏡拍照。

2.7Western blot實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染的4種宮頸癌細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化，離心收集細(xì)胞，加入200 μL RIPA細(xì)胞裂解液(50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，150 mmol/L NaCl，1% NP-40，0.5%脫氧膽酸鈉，0.1% SDS)重懸細(xì)胞，超聲破碎、12 000 r/min、4 ℃離心10 min，測定蛋白濃度。取30 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，孵育 I 抗[DYRK1A(1 ∶1 000)，γH2AX(1 ∶1 000)，p-ATM(1 ∶2 000)，ATM(1 ∶1 000)，p-p53(1 ∶5 000)]，以β-actin為內(nèi)參照，4 ℃孵育過夜。第2天用TBST洗膜3次、孵育 II 抗(HRP標(biāo)記)，室溫孵育1 h。化學(xué)發(fā)光法顯影，蛋白相對表達(dá)量用ImageJ軟件計(jì)算灰度值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

運(yùn)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間的比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 miR-1246在宮頸癌組織及細(xì)胞系中的表達(dá)水平

Real-time PCR結(jié)果顯示，miR-1246在宮頸癌組織中的表達(dá)水平顯著低于正常組織(P<0.05)；同時(shí)宮頸癌細(xì)胞系HeLa、CaSki、C33A和SiHa中miR-1246的表達(dá)水平顯著低于ESC細(xì)胞(P<0.05)；與NC-mimic組相比，轉(zhuǎn)染miR-1246 mimic的宮頸癌細(xì)胞中miR-1246表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)，見圖1。

Figure 1.The expression level of miR-1246 was detected by TaqMan real-time PCR in the cervical cancer tissues and cells. Mean±SD. n=3. △P<0.05 vs normal tissue; ** P<0.01 vs ESC; ## P<0.01 vs NC-mimic group.

2 miR-1246過表達(dá)對宮頸癌細(xì)胞輻射敏感性的影響

NC-mimic和miR-1246 mimic轉(zhuǎn)染的宮頸癌細(xì)胞經(jīng)電離輻射照射后，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長細(xì)胞活性均逐漸降低。與NC-mimic組比較，電離輻射照射后相同條件下，miR-1246過表達(dá)組細(xì)胞活性顯著降低(P<0.05)，見圖2。這一結(jié)果說明miR-1246過表達(dá)能增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞的輻射敏感性。

Figure 2.The effects of miR-1246 over-expression on the radiosensitivity of cervical cancer cells. Mean±SD. n=3. * P<0.05, **P<0.01 vs NC-mimic group.

3 miR-1246過表達(dá)對電離輻射誘導(dǎo)的宮頸癌細(xì)胞遷移的影響

電離輻射照射后，miR-1246過表達(dá)明顯抑制宮頸癌細(xì)胞的遷移，與NC-mimic組細(xì)胞比較，miR-1246過表達(dá)組HeLa、CaSki、C33A和SiHa細(xì)胞遷移率均顯著降低(P<0.05)，見圖3。這一結(jié)果說明miR-1246過表達(dá)協(xié)同電離輻射抑制宮頸癌細(xì)胞的遷移。

Figure 3.The effects of miR-1246 over-expression on the migration of cervical cancer cells induced by ionizing radiation (×20). Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNC-mimic group.

圖3miR-1246過表達(dá)對電離輻射誘導(dǎo)的宮頸癌細(xì)胞遷移的影響

4 miR-1246過表達(dá)對電離輻射誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞DNA損傷修復(fù)的影響

免疫熒光結(jié)果顯示，4種宮頸癌細(xì)胞經(jīng)電離輻射照射后2 h，γH2AX (DNA雙鏈斷裂標(biāo)志物)被明顯激活，提示電離輻射誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞DNA雙鏈斷裂；相同條件下，miR-1246過表達(dá)的宮頸癌細(xì)胞中γH2AX的熒光強(qiáng)度顯著高于轉(zhuǎn)染NC-mimic的細(xì)胞(P<0.01)，提示miR-1246過表達(dá)促進(jìn)電離輻射誘導(dǎo)的DNA損傷，增強(qiáng)細(xì)胞輻射敏感性，見圖4。

Figure 4.The effect of miR-1246 over-expression on repair of DNA damage in the cervical cancer cells induced by ionizing radiation (×100). Mean±SD. n=3. ** P<0.01 vs NC-mimic group.

5 miR-1246過表達(dá)對DNA損傷反應(yīng)的影響

Western blot結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-1246 mimic后，宮頸癌細(xì)胞系中DYRK1A(miR-1246下游靶基因編碼的蛋白)蛋白水平明顯增高，表明miR-1246在細(xì)胞中高表達(dá)。電離輻射照射后不影響DYRK1A的蛋白表達(dá)水平，而p-ATM、p-p53和γH2AX被明顯激活，總ATM蛋白水平無明顯變化；相同條件下，miR-1246過表達(dá)顯著抑制電離輻射誘導(dǎo)p-ATM的激活，ATM激酶下游底物磷酸化p53水平被顯著抑制，說明電離輻射誘導(dǎo)DNA損傷發(fā)生時(shí)，miR-1246過表達(dá)抑制ATM通路；而γH2AX水平顯著高于轉(zhuǎn)染NC-mimic的細(xì)胞，見圖5。這些結(jié)果提示，電離輻射誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂發(fā)生時(shí)，miR-1246通過抑制ATM通路，阻止損傷信號的傳遞，導(dǎo)致DNA損傷在細(xì)胞中積累最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

討 論

資料顯示，晚期宮頸癌患者的5年生存率僅為20%～50%，放射治療對于晚期轉(zhuǎn)移性宮頸癌的治療效果并不理想，大多數(shù)晚期宮頸癌患者對放療產(chǎn)生抵抗導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[16]，是宮頸癌患者死亡的主要原因。因此，尋找和研發(fā)宮頸癌靶向治療藥物迫在眉睫。

miRNA的發(fā)現(xiàn)和認(rèn)識為開發(fā)宮頸癌增敏劑的小分子藥物提供了嶄新的思路。大量研究發(fā)現(xiàn)miRNA作為腫瘤抑制因子或腫瘤促進(jìn)因子調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡、分化以及衰老，伴隨腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[5-9]。研究發(fā)現(xiàn)miR-1246在多種腫瘤組織或細(xì)胞中低表達(dá)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR-1246過表達(dá)通過調(diào)控p53、NFAT、DYRK1A和NFAT的表達(dá)進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[17-18]，認(rèn)為miR-1246是一個(gè)腫瘤抑制因子在腫瘤發(fā)生發(fā)展中扮演重要作用。本研究結(jié)果顯示，miR-1246在宮頸癌組織中的表達(dá)水平顯著低于正常對照組，體外研究證實(shí)miR-1246在4株宮頸癌細(xì)胞中低表達(dá)，而在正常子宮內(nèi)膜細(xì)胞系ESC中高表達(dá)，表明miR-1246的下調(diào)表達(dá)與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。為了進(jìn)一步研究miR-1246在宮頸癌細(xì)胞惡性表型中的作用，我們運(yùn)用miR-1246模擬物實(shí)現(xiàn)miR-1246在4株宮頸癌細(xì)胞中過表達(dá)，結(jié)果顯示，miR-1246過表達(dá)顯著抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖和遷移，電離輻射照射后，miR-1246過表達(dá)明顯抑制細(xì)胞活性以及增強(qiáng)輻射誘導(dǎo)細(xì)胞的遷移，表明miR-1246過表達(dá)增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞的輻射敏感性。有研究發(fā)現(xiàn)在輻射誘導(dǎo)致癌模型的腫瘤組織以及輻射誘導(dǎo)的癌細(xì)胞中，miR-1246的表達(dá)水平出現(xiàn)異常，提示miR-1246的異常表達(dá)與電離輻射后細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。

目前，宮頸癌放療耐受的分子機(jī)制仍不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，外界應(yīng)激如紫外線、電離輻射和活性氧自由基等刺激細(xì)胞引起DNA損傷時(shí)，p53通路被激活，通過激活下游靶基因p21的轉(zhuǎn)錄活性，使細(xì)胞周期阻滯，促進(jìn)DNA損傷修復(fù)，無法修復(fù)的細(xì)胞通過細(xì)胞凋亡途徑被清除[19]。γH2AX是DNA雙鏈斷裂的標(biāo)志物，電離輻射殺死腫瘤細(xì)胞主要通過誘導(dǎo)細(xì)胞DNA斷裂，引起無法修復(fù)的DNA損傷最終誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[20]。本研究結(jié)果顯示，miR-1246過表達(dá)的宮頸癌細(xì)胞中γH2AX表達(dá)水平顯著高于對照組細(xì)胞，提示miR-1246過表達(dá)DNA損傷加劇或DNA損傷修復(fù)功能被抑制，提示miR-1246過表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞中發(fā)生DNA損傷的積累。目前關(guān)于miR-1246在DNA損傷修復(fù)中的研究尚未報(bào)道，本研究發(fā)現(xiàn)miR-1246過表達(dá)促進(jìn)電離輻射誘導(dǎo)γH2AX的激活，表明miR-1246具有抑制DNA損傷修復(fù)的功能。本研究進(jìn)一步研究miR-1246抑制DNA損傷修復(fù)分子機(jī)制。有研究表明DNA損傷發(fā)生時(shí)，PI3K家族激酶如ATM和ATR和DNA-PK通路的激活在DNA損傷修復(fù)中起著關(guān)鍵作用，ATM、ATR激酶作為DNA損傷感受器，DNA DSB主要激活A(yù)TM通路，使下游底物如p53、CHK1、CHK2和MDC1等磷酸化，通過級聯(lián)放大方式傳遞損傷信號，招募損傷修復(fù)因子或蛋白至DSB位點(diǎn)促進(jìn)DNA損傷修復(fù)[21]。本研究結(jié)果顯示miR-1246過表達(dá)促進(jìn)電離輻射誘導(dǎo)γH2AX的激活，抑制p-p53水平，提示miR-1246過表達(dá)抑制ATM通路，損傷加劇。本研究結(jié)果表明，miR-1246過表達(dá)通過抑制電離輻射誘導(dǎo)ATM通路的激活，阻斷DNA損傷信號的傳遞，損傷積累誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，最終增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞的輻射敏感性。本研究為以miR-1246為靶點(diǎn)研發(fā)宮頸癌小分子放療增敏劑提供了理論依據(jù)。

Figure 5.The effects of miR-1246 over-expression on DNA damage responses in cervical cancer cells. Mean±SD. n=3. △△P<0.01 vs NC-mimic group; * P<0.05, ** P<0.01 vs NC-mimic+10 Gy group.