李曉偉， 王 躍， 韓 碩， 孫永奇， 李玲玲， 劉 壯， 張曉晟， 劉 月， 趙淑敏， 紀(jì)海茹

(承德醫(yī)學(xué)院， 河北 承德 067000)

突觸作為神經(jīng)元與其它細(xì)胞傳遞信息的特殊結(jié)構(gòu)，對(duì)維持大腦神經(jīng)的正常功能具有重要作用。腦缺血會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元脫失、變性及結(jié)構(gòu)和功能的改變，進(jìn)而改變突觸的形態(tài)與結(jié)構(gòu)，影響神經(jīng)信息傳遞和神經(jīng)功能恢復(fù)[1-3]。治療由缺血引起的腦卒中時(shí)可以通過(guò)修復(fù)突觸，提高突觸可塑性，進(jìn)而促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。葛根素(puerarin,Pue)有抗衰老、抗炎、改善微循環(huán)、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞及改善學(xué)習(xí)記憶等作用，在心腦血管疾病的治療中取得了良好的療效[4-5]，但目前關(guān)于葛根素對(duì)缺血再灌注(ischemia-reperfusion,IR)大鼠神經(jīng)功能與大腦皮質(zhì)突觸形態(tài)結(jié)構(gòu)及參數(shù)影響的報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察葛根素干預(yù)后腦缺血再灌注大鼠大腦皮質(zhì)突觸形態(tài)結(jié)構(gòu)及參數(shù)的變化，探討其對(duì)神經(jīng)損傷的作用及機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1動(dòng)物 69只雄性SD大鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，體質(zhì)量260～280 g，許可證號(hào)為SCXK(京)2016-0001。

1.2藥品及儀器 葛根素注射劑(2 mL：0.1 g；國(guó)藥準(zhǔn)字H20034082)購(gòu)自哈爾濱松鶴制藥有限公司；尼莫地平(nimodipine，NIM)注射劑購(gòu)自拜爾醫(yī)藥保健有限公司。透射電鏡(Hitachi，H-7650)；超薄切片機(jī)(Leica，EMUC6)。

2 方法

2.1分組與造模 將69只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(sham組)、模型組(IR組)、Pue組和尼莫地平陽(yáng)性對(duì)照組(NIM組)，假手術(shù)組15只，其余3組每組18只。大鼠參照線栓法制備右側(cè)大腦中動(dòng)脈局灶性缺血再灌注模型，假手術(shù)組僅分離血管，不插入線栓。缺血2 h后，再灌注24 h。大鼠清醒后，參照Longa 5級(jí)4分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[6]進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分，剔除造模評(píng)分0分及4分和不符合實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)的大鼠，并及時(shí)補(bǔ)遺。術(shù)后大鼠單籠飼養(yǎng)，給予8×104U青霉素腹腔注射抗感染。

2.2給藥 Pue組和NIM組大鼠于腦缺血再灌注后分別立即腹腔內(nèi)注射Pue (8 mg·kg-1·d-1)和NIM (1 mg·kg-1·d-1)；sham組及IR組相同時(shí)點(diǎn)給予等體積的生理鹽水，直至相應(yīng)時(shí)點(diǎn)。

2.3神經(jīng)功能缺損評(píng)分 術(shù)后第3、7和14天采取改良的神經(jīng)功能缺損評(píng)分(modified neurological severity score，mNSS)評(píng)價(jià)大鼠神經(jīng)功能缺損狀況。mNSS主要包括提尾反射、行走測(cè)試、感覺(jué)測(cè)試、平衡測(cè)試、反射缺失和反常運(yùn)動(dòng)，各項(xiàng)目總和記為最終評(píng)分：1～6分為輕度損傷，7～12分為中度損傷，13～18分為嚴(yán)重?fù)p傷[7-8]。

2.4電鏡檢測(cè)突觸超微結(jié)構(gòu)的變化 各實(shí)驗(yàn)組大鼠腹腔內(nèi)麻醉后，經(jīng)左心室灌注4%多聚甲醛和2%戊二醛混合固定液固定。取缺血區(qū)大腦皮質(zhì)，常規(guī)電鏡樣品制備，H-7650透射電鏡觀察并采集照片。電鏡下圖片放大5萬(wàn)倍，每只大鼠取不同部位10張，采用Quantiment-520 圖像分析儀測(cè)量突觸活性區(qū)長(zhǎng)度、突觸間隙寬度、突觸后膜弦長(zhǎng)和弧長(zhǎng)及突觸后致密物(postsynaptic density，PSD)厚度。測(cè)量活性區(qū)長(zhǎng)度與PSD厚度參考Guldner法，計(jì)算突觸界面曲率參照J(rèn)ones法，多點(diǎn)平均法測(cè)定突觸間隙寬度，取其均數(shù)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，析因設(shè)計(jì)的方差分析檢驗(yàn)突觸形態(tài)結(jié)構(gòu)參數(shù)，兩組間比較采用q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 神經(jīng)功能缺損評(píng)分

與IR組相比，用藥組各時(shí)點(diǎn)神經(jīng)功能缺損評(píng)分均降低(P<0.05)，Pue組和NIM組2組間評(píng)分的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。用藥3、7和14 d后各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分逐次降低，且用藥7 d和14 d時(shí)行為學(xué)評(píng)分明顯優(yōu)于3 d(P<0.05)，但用藥7 d與14 d的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠改良神經(jīng)功能缺損評(píng)分的變化

*P<0.05,**P<0.01vssham group;△P<0.05vsIR group;#P<0.05vs3 d.

2 電鏡檢測(cè)突觸超微結(jié)構(gòu)變化

電鏡下觀察sham組突觸數(shù)目較多，輪廓清晰，前后膜完整，突觸前成分內(nèi)突觸囊泡呈均等、密集的圓形清亮小泡，突觸后致密帶較寬、高密度，厚度均勻，突觸間隙清晰；IR組各時(shí)點(diǎn)較相應(yīng)時(shí)點(diǎn)sham組突觸數(shù)目明顯減少，前后膜及間隙模糊，突觸囊泡數(shù)目顯著減少、密度不均，突觸后細(xì)胞終末胞質(zhì)嚴(yán)重破壞，呈空泡變性，突觸后致密帶密度降低，突觸界面曲率明顯減?。籔ue組和NIM組各時(shí)點(diǎn)較IR組突觸密集，突觸形態(tài)接近sham組，突觸囊泡數(shù)量較IR組增多，凹形突觸增加，常見(jiàn)兩個(gè)活性點(diǎn)，突觸后細(xì)胞終末胞質(zhì)變性溶解顯著減輕，致密物增厚，間隙減小，突觸界面曲率增加。用藥組各時(shí)點(diǎn)均呈逐漸好轉(zhuǎn)趨勢(shì)，且7 d和14 d明顯優(yōu)于3 d，但用藥7 d與14 d無(wú)明顯差異，見(jiàn)圖1。

Figure 1. The ultrastructural alterations in cerebral cortex of rats in each group at different time points (×50 000, bar=500 nm).

IR組各時(shí)點(diǎn)突觸界面曲率均呈下降趨勢(shì)，與sham組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與IR組相比，用藥組各時(shí)點(diǎn)突觸界面曲率均明顯增加(P<0.05)，但Pue組和NIM組突觸界面曲率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。用藥組各時(shí)點(diǎn)突觸界面曲率逐漸增加；用藥7 d和14 d明顯大于3 d(P<0.05)；且用藥7 d與14 d的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)表2。

IR組各時(shí)點(diǎn)PSD厚度均呈下降趨勢(shì)，與sham組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與IR組相比，用藥組各時(shí)點(diǎn)PSD厚度均明顯增加(P<0.05)，Pue組和NIM組PSD厚度的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。用藥組各時(shí)點(diǎn)PSD厚度逐漸增加；用藥7 d和14 d，PSD的厚度明顯大于3 d(P<0.05)；且用藥7 d與14 d的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)表3。

表2 各組大鼠大腦皮質(zhì)突觸界面曲率變化的比較

*P<0.05vssham group;△P<0.05vsIR group;#P<0.05vs3 d.

表3 各組大鼠大腦皮質(zhì)PSD厚度變化的比較

*P<0.05,**P<0.01vssham group;△P<0.05vsIR group;#P<0.05vs3 d.

IR組各時(shí)點(diǎn)突觸間隙均呈上升趨勢(shì)，與sham組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與IR組相比，用藥組各時(shí)點(diǎn)突觸間隙寬度均明顯下降(P<0.05)，Pue組和NIM組突觸間隙寬度的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。用藥組各時(shí)點(diǎn)突觸間隙寬度逐漸下降；用藥7 d和14 d，突觸間隙寬度明顯大于3 d(P<0.05)；且用藥7 d與14 d的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠大腦皮質(zhì)突觸間隙寬度變化的比較

*P<0.05,**P<0.01vssham group;△P<0.05vsIR group;#P<0.05vs3 d.

討 論

隨著世界老齡化進(jìn)程的加快，缺血性腦卒中發(fā)病率越來(lái)越高，日益成為致死致殘主要因素[9]，常伴發(fā)不同程度的感覺(jué)、運(yùn)動(dòng)和認(rèn)知等功能障礙，其高致殘和致死率嚴(yán)重影響人民的生活[10-11]。葛根素對(duì)缺血性腦損傷的恢復(fù)起著積極的作用，對(duì)于抑制神經(jīng)元損傷，減輕神經(jīng)功能缺損也有一定作用[12]。突觸是神經(jīng)元與其它神經(jīng)元或效應(yīng)細(xì)胞之間相互接觸并借以傳導(dǎo)沖動(dòng)的結(jié)構(gòu)，是信息傳遞的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。突觸結(jié)構(gòu)的數(shù)量與完整對(duì)保證神經(jīng)元獲得、加工、貯存及傳遞信息起著至關(guān)重要的作用[13]。突觸具有較大的可塑性，在環(huán)境變化或受損時(shí)，其結(jié)構(gòu)與功能會(huì)發(fā)生相應(yīng)變化，從而改善學(xué)習(xí)記憶與肢體運(yùn)動(dòng)能力[14]。

突觸可塑性是神經(jīng)功能重建的重要機(jī)制[15]，在缺血后神經(jīng)功能的恢復(fù)中起關(guān)鍵作用[10]。缺血性腦損傷發(fā)生后，腦實(shí)質(zhì)缺血所引起的壞死及再灌注后所引起的凋亡常可引發(fā)感覺(jué)、運(yùn)動(dòng)障礙等一系列神經(jīng)功能缺損，因此臨床上常通過(guò)神經(jīng)功能缺損評(píng)分對(duì)神經(jīng)受損情況進(jìn)行有效評(píng)價(jià)。動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)不僅可以評(píng)價(jià)缺血性腦損傷后殘存神經(jīng)功能，而且可以用來(lái)評(píng)估治療手段對(duì)神經(jīng)功能的保護(hù)效果[16]。在本課題的mNSS檢測(cè)中，發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注大鼠均迅速呈現(xiàn)明顯的運(yùn)動(dòng)障礙，用藥后運(yùn)動(dòng)障礙均有好轉(zhuǎn)，但未回歸正常運(yùn)動(dòng)，用藥7 d、14 d較3 d行為學(xué)評(píng)分有明顯降低，用藥7 d與14 d的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，表明葛根素明顯改善了腦缺血再灌注后的神經(jīng)功能。

突觸界面曲率的轉(zhuǎn)變是突觸可塑性的潛在特征，曲型突觸比直型突觸擁有更多可產(chǎn)生能量的線粒體，可提供更多的能量，使突觸處于興奮狀態(tài)。曲型突觸較直型突觸更能擴(kuò)大接觸面積[8],同時(shí)限制釋放的神經(jīng)遞質(zhì)擴(kuò)散，保證更多的神經(jīng)遞質(zhì)到達(dá)突觸后膜，有利于神經(jīng)遞質(zhì)與后膜受體更充分的結(jié)合及神經(jīng)遞質(zhì)作用受體后被重新攝取，從而提升信息傳導(dǎo)的有效性與迅速性，由此推斷突觸界面曲率增大可能是一種代償作用。本研究用電鏡觀測(cè)Pue和NIM組的突觸界面曲率明顯大于IR組，用藥7 d、14 d較3 d的突觸界面曲率有明顯增大，但用藥7 d與14 d的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明應(yīng)用葛根素7 d可促進(jìn)突觸功能代償。

PSD是突觸后膜的一層均質(zhì)致密物，由突觸后膜分化物組成。PSD 厚度與突觸機(jī)能變化密切相關(guān)，是反映突觸可塑性的形態(tài)學(xué)參數(shù)[17]。PSD 含有多種酶與蛋白質(zhì), 在酶的催化下蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的可逆性改變能引起其亞微結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變(厚度增大或減小)。PSD形態(tài)變化可能與突觸后膜上受體及離子通道的變化密切相關(guān)，PSD 增厚和增長(zhǎng)可能是突觸功效增強(qiáng)的物質(zhì)基礎(chǔ)[8]。本研究顯示與IR組相比，Pue和NIM組腦缺血側(cè)皮質(zhì)PSD厚度顯著增加。用藥7 d、14 d較3 d時(shí)PSD厚度明顯增加，用藥7 d與14 d的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，證明葛根素可增強(qiáng)突觸功效。

突觸間隙寬度可改變神經(jīng)遞質(zhì)的有效率。間隙寬度減小，可減少神經(jīng)遞質(zhì)的擴(kuò)散，增高利用度，實(shí)驗(yàn)中，Pue、NIM組腦缺血皮質(zhì)區(qū)較IR組均變窄，與IR組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，用藥7 d、14 d較3 d行為學(xué)評(píng)分明顯降低，用藥7 d與14 d的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Pue與現(xiàn)階段臨床用藥尼莫地平的比較，證實(shí)Pue與NIM所達(dá)到的治療效果相似，均能有效修復(fù)腦缺血再灌注大鼠大腦皮質(zhì)突觸結(jié)構(gòu)，提高突觸可塑性，改善大鼠神經(jīng)功能，且其價(jià)格低廉，具有明顯的經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢(shì)，預(yù)測(cè)葛根素有可能成為新型治療臨床缺血性腦卒中的藥物。