項冰倩， 高 慧， CHEN Jun-hao, 樓國強(qiáng)， 周卓琳， 武垣伶， 張晶晶， 許益笑， 王萬鐵△

(1溫州醫(yī)科大學(xué)缺血/再灌注損傷研究所， 浙江 溫州 325035； 2浙江省臺州醫(yī)院病理科， 浙江 臨海 317000；3School of Biomedical Sciences, University of Western Australia, Perth 6000, Australia)

肺缺血/再灌注損傷(pulmonary ischemia/reperfusion injury，PIRI)是指肺組織細(xì)胞缺血一定時間后，再恢復(fù)血流灌注，組織細(xì)胞的損傷程度迅速加劇。PIRI是一種復(fù)雜且廣泛的病理生理學(xué)過程，心血管系統(tǒng)疾病及大血管手術(shù)、器官移植術(shù)、膿毒血癥和失血性休克時均存在PIRI現(xiàn)象，同時PIRI也是溶栓及肺移植術(shù)后嚴(yán)重影響患者預(yù)后的關(guān)鍵因素之一[1]。近年來，細(xì)胞自噬與PIRI關(guān)系的研究備受關(guān)注。自噬是指真核細(xì)胞通過溶酶體降解細(xì)胞中受損的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器，從而維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，是真核生物進(jìn)化后高度保守的一種細(xì)胞自穩(wěn)程序[2-4]。在生理情況下，自噬維持在較低的水平，通過降解多余的或?qū)?xì)胞有損傷作用的細(xì)胞器與蛋白質(zhì)，為細(xì)胞提供保護(hù)作用[5]；在病理情況下，如氧化應(yīng)激、細(xì)胞營養(yǎng)缺乏及缺血/再灌注損傷等能誘導(dǎo)過度的自噬，過度自噬可破壞細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)和功能均正常的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器，有時能導(dǎo)致自噬性細(xì)胞死亡[6]。研究表明[2]自噬參與肺缺血/再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展，但其具體發(fā)生機(jī)制目前尚未完全闡明。

維甲酸X受體(retinoid X receptor，RXR)屬于核受體超家族中的一個子家族，作為配體轉(zhuǎn)錄因子，RXR在細(xì)胞內(nèi)可與自身結(jié)合形成同源二聚體，或與其它因子形成異源二聚體[7]。在配體的作用下，核受體被激活后，通過與反應(yīng)元件(response element，RE)的特異性DNA序列結(jié)合來控制靶基因表達(dá)的水平。被激活后的RXR在體內(nèi)可對脊椎動物細(xì)胞的分化、發(fā)育、死亡及新陳代謝產(chǎn)生影響，在體外可誘導(dǎo)部分腫瘤細(xì)胞系的分化。研究表明， RXR在機(jī)體內(nèi)可通過多條信號通路干預(yù)心血管及腫瘤、各類皮膚病、糖尿病等疾病的病理發(fā)展過程[8-11]，但RXR是否參與了肺缺血/再灌注損傷目前尚不明確。因此，本實驗通過建立大鼠肺缺血/再灌注模型，明確細(xì)胞自噬對缺血/再灌注肺的影響；同時用RXR激動劑與抑制劑對模型進(jìn)行干預(yù)，探討RXR在PIRI中的可能作用及機(jī)制，以及對PIRI期間發(fā)生的細(xì)胞自噬的調(diào)控作用，為將來RXR的臨床應(yīng)用治療提供充分的實驗依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1 動物

SPF級健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠70 只，體重(200±20) g，由溫州醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，許可證號為SCXK (浙)2015-0009。

2 主要試劑

9-順式維甲酸(9-cis-retinoic acid, 9cRA)和HX531(Sigma)；抗LC3、mTOR/p-mTOR、beclin 1和GAPDH抗體(Abcam)；抗RXRα抗體(Bioss)；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔 II 抗(中國博蘊(yùn))；免疫熒光 II 抗(上海翊圣生物科技有限公司)；牛血清白蛋白(Gibco)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo)；BCA蛋白定量試劑盒和DAPI染色液(中國碧云天生物技術(shù)研究所)。

3 主要方法

3.1實驗分組及大鼠肺缺血/再灌注模型的制備 采用隨機(jī)數(shù)字表法將SD大鼠分為7組，每組10只：正常對照(control,C)組、假手術(shù)(sham,S)組、假手術(shù)+RXR激動劑9-順式維甲酸(S+9cRA，SRA)組、假手術(shù)+RXR抑制劑HX531(S+HX531，SH)組、肺缺血/再灌注(I/R)組、肺缺血/再灌注+9-順式維甲酸(RA)組和肺缺血/再灌注+HX531(HX531)組。C組不做任何處理；S組術(shù)前不注射任何藥物，術(shù)中只行氣管插管和開胸，不夾閉左側(cè)肺門，行機(jī)械通氣210 min；SRA組術(shù)前90 min 腹腔注射9-順式維甲酸(5 mg/kg)；SH組術(shù)前90 min和術(shù)前30 min分別腹腔注射9-順式維甲酸(5 mg/kg)和HX531(5 mg/kg)；I/R組術(shù)前不注射任何藥物，術(shù)中行左肺門阻斷30 min再灌注180 min；RA組術(shù)前90 min 腹腔注射9-順式維甲酸(5 mg/kg)；HX531組術(shù)前90 min和術(shù)前30 min分別腹腔注射9-順式維甲酸(5 mg/kg)和HX531(5 mg/kg)。

依據(jù)文獻(xiàn)采用SD大鼠在體左側(cè)肺門夾閉制備缺血/再灌注模型[12]：5%的水合氯醛以10 mL/kg腹腔注射進(jìn)行麻醉，消毒胸頸部皮膚后切開并分離皮下組織和肌肉，暴露氣管T型切開，氣管插管后接呼吸機(jī)行機(jī)械通氣,呼吸機(jī)參數(shù)為：吸呼比為3∶ 4，呼吸頻率為70次/min，100%氧濃度，潮氣量30 mL/min。于左胸部3～5肋間處開胸并游離左側(cè)肺門，動脈夾阻斷左肺門30 min，30 min后恢復(fù)血流再灌注180 min。灌注結(jié)束后處死大鼠并取肺組織。

3.2肺組織病理學(xué)觀察及肺泡損傷定量指標(biāo)的評估 實驗結(jié)束后，立即用已消毒的眼科剪取大鼠左下肺大小約1 cm×1 cm×1 cm 的肺組織，經(jīng)預(yù)冷的PBS緩沖液漂洗后放入裝有4%多聚甲醛的離心管內(nèi)，進(jìn)行組織固定(固定時間約2～3天)。組織固定后經(jīng)梯度乙醇脫水、包埋、切片、脫蠟后進(jìn)行HE染色，隨后光學(xué)顯微鏡(×200)下觀察各組肺組織標(biāo)本的形態(tài)學(xué)變化。在×400視野下每張切片隨機(jī)連續(xù)觀察50個視野，計算每個視野下的損傷肺泡數(shù)及總肺泡數(shù)(當(dāng)肺泡內(nèi)出現(xiàn)水腫滲出液或出現(xiàn)紅細(xì)胞或白細(xì)胞超過2個以上時均可視為損傷的肺泡)，計算損傷肺泡數(shù)與總肺泡數(shù)的比值，把損傷肺泡數(shù)占總肺泡數(shù)的百分比值作為肺泡損傷定量評估指數(shù)(index of quantitative assessment，IQA)。

3.3免疫熒光法檢測肺組織RXRα的表達(dá)量 實驗結(jié)束后取各組大鼠左下肺大小約1 cm × 1 cm × 1 cm的肺組織，經(jīng)預(yù)冷PBS緩沖液漂洗后放入裝有4%多聚甲醛的離心管內(nèi)，進(jìn)行組織固定，常規(guī)行石蠟包埋切片，經(jīng)脫蠟、水化、孵育、煮片、 I 抗及 II 抗的結(jié)合、胞核染色、封片后，暗室下用正置熒光顯微鏡(×400)觀察RXRα的表達(dá)并拍片。

3.4RT-PCR法檢測肺組織中LC3、beclin 1和mTOR 的mRNA表達(dá) 取大鼠肺組織加液氮研磨，以 TRIzol 法提取總RNA，測定RNA濃度，按照RT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行cDNA合成及擴(kuò)增。PCR參數(shù)為：預(yù)變性94 ℃ 3 min；變性94 ℃ 30 s，退火60 ℃ 30 s，延伸 72 ℃ 1 min，循環(huán) 33 次；終止延伸72 ℃ 5 min。以GAPDH為內(nèi)參照。引物序列見表1。結(jié)果用 Quantity One 分析。以目的基因條帶灰度值和內(nèi)參照條帶灰度值的比值反映其表達(dá)水平。

表1 RT-PCR的引物序列

3.5Western blot檢測肺組織LC3-II、beclin 1和p-mTOR的蛋白水平 低溫下充分研磨肺組織，以400 μL RIPA(含4 μL PMSF)裂解組織，混勻后吸取勻漿液4 ℃離心取上清，BCA 蛋白定量試劑盒測蛋白濃度并繪標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品蛋白定量成2 g/L，變性煮沸10 min。配膠進(jìn)行電泳，上樣量20 μg，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，5% 脫脂奶粉室溫封閉2 h， TBST漂洗， I 抗(LC3-II、beclin 1和p-mTOR 抗體)均以1 ∶1 000稀釋；GAPDH 抗體以1 ∶5 000稀釋，4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次，每次7 min, II 抗室溫孵育1 h。TBST洗滌3次，每次5 min，加ECL工作液，反應(yīng)2 min，暗室曝光，顯影、定影后，凝膠分析軟件分析蛋白條帶灰度值。取目的蛋白條帶灰度值和內(nèi)參照GAPDH條帶灰度值的比值。計算p-mTOR與mTOR的比值，以反映mTOR蛋白的磷酸化水平。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組大鼠肺組織光鏡觀察結(jié)果

光鏡下觀察可見，C組肺間質(zhì)及肺泡結(jié)構(gòu)清晰完整，肺泡壁薄，間質(zhì)無水腫，無炎癥細(xì)胞浸潤，肺泡內(nèi)未見滲出液或紅細(xì)胞漏出；S組、SRA組和SH組肺間質(zhì)及肺泡結(jié)構(gòu)基本完整，無肺間質(zhì)增寬，肺毛細(xì)血管輕微擴(kuò)張充血，肺泡腔內(nèi)可見散在分布的紅細(xì)胞與炎性細(xì)胞，未見透明膜形成；I/R組與HX531組肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，偶見部分肺泡變形塌陷，局部肺泡壁有水腫增厚或破裂，肺間質(zhì)水腫，肺毛細(xì)血管局部擴(kuò)張、充血，白細(xì)胞滲出，肺泡腔內(nèi)可見大量紅細(xì)胞漏出，肺泡壁內(nèi)有較多炎性細(xì)胞浸潤；與I/R組和HX531組相比，RA組肺泡結(jié)構(gòu)輕微紊亂，肺泡塌陷、變形數(shù)量減少，肺間質(zhì)水腫及肺毛細(xì)血管擴(kuò)張、出血程度均有明顯減輕，肺泡腔內(nèi)紅細(xì)胞漏出減少，肺泡壁內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤程度減輕，見圖1。

2 各組大鼠肺泡損傷定量評估結(jié)果

與C組相比，SRA、SH組和S組的IQA差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性；與C組相比，I/R組、RA組和HX531組的IQA明顯升高(P<0.05)；與I/R組相比，RA組的IQA明顯下降(P<0.05)，而與HX531組比較差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性；與RA組相比，HX531組的IQA明顯升高(P<0.05)，見圖1。

Figure 1.HE staining of lung tissue and the change of IQA in each group (×400). Mean±SD. n=10. ** P<0.01 vs C group; ## P<0.01 vs S group; △△ P<0.01 vs I/R group; ▲▲P<0.01 vs RA group.

3 各組大鼠肺組織RXRα免疫熒光結(jié)果

光鏡下觀察可見，C組、S組、SH組的RXRα表達(dá)量較低，SRA組的RXRα表達(dá)量較高；與C組、S組和SH組相比，I/R組、RA組與HX531組的RXRα表達(dá)量輕度增加；與I/R組和HX531組相比，RA組RXRα表達(dá)水平有所增高；I/R組和HX531組RXRα表達(dá)水平無明顯差異，見圖2。

4 各組大鼠肺組織RT-PCR檢測結(jié)果

與C組相比，I/R組、RA組和HX531組的LC3和beclin 1的mRNA表達(dá)明顯升高，mTOR的mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.01)；與I/R組相比，RA組LC3和beclin 1的mRNA表達(dá)明顯下降，mTOR的mRNA表達(dá)明顯增高(P<0.01)，而與HX531組比較差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性；與RA組相比，HX531組的LC3和beclin 1 mRNA表達(dá)明顯升高，mTOR的mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.01)，見圖3。

Figure 2.Immunofluorescence of RXRα in the lung tissues from each group (×400).

Figure 3.The mRNA expression of LC3, beclin 1 and mTOR in each group. M: DNA marker. Mean±SD. n=10. **P<0.01 vs C group; ##P<0.01 vs S group; △△P<0.01 vs I/R group;▲▲P<0.01 vs RA group.

5 各組大鼠肺組織Western blot檢測結(jié)果

與C組相比，I/R組、RA組和HX531組的LC3-II和beclin 1蛋白表達(dá)明顯升高，p-mTOR的蛋白水平明顯降低(P<0.01)；與I/R組相比，RA組LC3-II和beclin 1的蛋白水平明顯下降，p-mTOR的蛋白水平明顯增高(P<0.01)，而與HX531組比較差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性；與RA組相比，HX531組的LC3-II和beclin 1蛋白水平明顯升高，p-mTOR的蛋白水平明顯降低(P<0.01)，見圖4。

Figure 4.The protein levels of LC3-II, beclin 1 and p-mTOR in each group. Mean±SD. n=10. ** P<0.01 vs C group; ##P<0.01 vs S group; △△P<0.01 vs I/R group; ▲▲P<0.01 vs RA group.

討 論

維甲酸X受體是細(xì)胞核內(nèi)重要的受體之一，在人體內(nèi)分布范圍較廣泛，其通過與不同的配體，在炎癥、腫瘤、胚胎發(fā)育、物質(zhì)代謝及造血異常等多類疾病中起著重要的作用。RXR在細(xì)胞內(nèi)通常以異源二聚體的形式存在，異源二聚體本身不具有任何的生物學(xué)性能，真正能夠發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的是異源二聚體與配體結(jié)合形成的復(fù)合體[13-15]。當(dāng)異源二聚體被成功激活后轉(zhuǎn)變成轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，隨后與目標(biāo)基因進(jìn)行結(jié)合，通過調(diào)節(jié)目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)水平發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。研究表明，RXRα在正常細(xì)胞的增殖與分化中起著重要的作用，其功能及表達(dá)的異常與人類中多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。因此，RXRα被認(rèn)為是腫瘤治療及預(yù)防的重要靶點之一。除了腫瘤，RXRα還廣泛參與各類物質(zhì)的代謝調(diào)節(jié)，如膽固醇、脂肪、膽汁酸和維生素D等代謝以及葡萄糖的內(nèi)穩(wěn)態(tài)[13-17]。

PIRI的發(fā)生是機(jī)體多通路、多途徑共同調(diào)控的結(jié)果，目前研究認(rèn)為細(xì)胞自噬信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在臟器I/R中起重要作用。自噬是指細(xì)胞內(nèi)變性、衰老和受損的細(xì)胞器和蛋白質(zhì)被運(yùn)輸?shù)饺苊阁w，溶酶體對其進(jìn)行消化降解，以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)雙層膜結(jié)構(gòu)包裹部分胞質(zhì)和細(xì)胞器的自噬小體為判斷指標(biāo)的細(xì)胞自我消化過程。以往的研究發(fā)現(xiàn)，在生理狀態(tài)下，細(xì)胞自噬維持在較低的基線水平。在機(jī)體遭受某些刺激時，如缺血/再灌注和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等，體內(nèi)自噬水平會出現(xiàn)適度的增高，以減輕這些病變所引起的損傷。但隨著自噬水平過度的增高，機(jī)體會伴隨自噬性細(xì)胞死亡和細(xì)胞丟失等變化，說明自噬既是細(xì)胞內(nèi)的一種防御和應(yīng)激調(diào)控機(jī)制，也是細(xì)胞損傷的重要機(jī)制之一[18-19]。

作為細(xì)胞內(nèi)重要的物質(zhì)代謝方式之一，自噬的發(fā)生和發(fā)展均受到機(jī)體嚴(yán)格的控制和調(diào)節(jié)。自噬由自噬相關(guān)基因(autophagy-associated gene，ATG)進(jìn)行嚴(yán)密調(diào)控，主要包括磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)、自噬相關(guān)基因3和自噬相關(guān)基因6(beclin 1)等。目前已知的自噬調(diào)節(jié)相關(guān)通路有多條，其中磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B(protein kinase B)- 雷帕霉素靶蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(PI3K-Akt-mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路)是調(diào)控自噬的唯一抑制性通路；自噬激活經(jīng)典轉(zhuǎn)導(dǎo)通路包括腺苷酸激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)通路和beclin 1-PI3K III通路[20-22]。在哺乳動物中，微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)通過2條泛素樣蛋白加工修飾過程參與自噬泡的形成，LC3最開始以前LC3的形式存在，隨后立刻被Atg4B切割，形成胞漿可溶性形式LC3-I。在自噬發(fā)生過程中，LC3-I在Atg5-Atg12-Atg16復(fù)合物的協(xié)助下經(jīng)過多次修飾后形成具有膜結(jié)合能力的LC3-II。LC3-II定位于前自噬體與自噬體，與自噬體膜穩(wěn)定結(jié)合，表達(dá)量與自噬泡數(shù)量成正比，在某種程度反映了自噬小體的數(shù)量，通常被當(dāng)作哺乳動物中自噬體膜的標(biāo)記蛋白，通過檢測LC3蛋白的含量，可以粗略判斷機(jī)體自噬的表達(dá)情況[23-26]。mTOR為保守進(jìn)化的絲-蘇氨酸蛋白激酶，是磷脂酰肌醇激酶相關(guān)蛋白激酶(phosphatidylinositol-kinase-related protein kinase，PIKK)的家族成員之一，參與機(jī)體細(xì)胞一系列的活動，如細(xì)胞的生長、能量代謝、細(xì)胞增殖、凋亡與存活等。研究表明，mTOR至少存在著mTORC1和mTORC2兩種復(fù)合物，其中mTORC1由多種蛋白質(zhì)組成，參與了體內(nèi)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄、翻譯和自噬等過程，并且對自噬激動劑雷帕霉素高度敏感。mTORC1通路是機(jī)體內(nèi)多條信號通路的交匯點，通過對其上游信號，如AMPK-mTORC1及Class I PI3K-AKT-mTORC1信號通路，或其下游信號，如ULK1分子等的轉(zhuǎn)導(dǎo)來調(diào)控細(xì)胞自噬水平。細(xì)胞若處于正常生長狀態(tài)時，mTORC1會下調(diào)自噬信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，使機(jī)體維持一個較低的基礎(chǔ)自噬水平；若細(xì)胞處于應(yīng)激，比如在饑餓狀態(tài)下，mTORC1功能會被抑制，導(dǎo)致自噬被PI3K-AMPK/mTOR信號通路軸所激活[27-30]。腫瘤抑制蛋白beclin 1是自噬調(diào)控程序中重要的調(diào)控蛋白，它能與抗凋亡蛋白Bcl-2直接發(fā)生相互作用，當(dāng)beclin 1與Bcl-2結(jié)合時，beclin 1的功能被抑制，不能激活自噬。當(dāng)促凋亡蛋白BH3催化beclin 1從Bcl-2解離后，beclin 1即能誘導(dǎo)啟動自噬程序；相反的，若Bcl-2或者其它Bcl-xL家族成員發(fā)生過表達(dá)時，beclin 1與其結(jié)合從而導(dǎo)致自噬被抑制[31]。

本研究結(jié)果顯示，C組、S組、SRA組和SH組檢測指標(biāo)變化的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，肺組織形態(tài)學(xué)變化也相差不大，表明肺組織無缺血/再灌注時，單純的手術(shù)操作和藥物對大鼠肺影響不大；與C組相比，I/R組、RA組和HX531組的肺IQA、自噬促進(jìn)蛋白LC3-II和beclin 1的水平升高，自噬抑制蛋白p-mTOR水平則降低，提示缺血/再灌注時，肺組織誘發(fā)自噬水平的上調(diào)，造成肺組織的損傷；將RA組和HX531組與I/R組相互比較，我們發(fā)現(xiàn)使用9-順式維甲酸激活RXR后，RXRα表達(dá)量、p-mTOR的蛋白水平升高；肺IQA、LC3-II和beclin 1的水平則降低；而使用HX531抑制RXR后則出現(xiàn)了相反的變化，這種實驗結(jié)果反差表明激活RXR可以降低細(xì)胞自噬水平，減少肺毛細(xì)血管的損傷和肺泡滲出液，改善肺換氣功能，減輕缺血/再灌注肺損傷；而抑制RXR則會上調(diào)細(xì)胞自噬水平，加重肺組織損傷。在單培仁等[32]的研究中，他們證實缺氧/復(fù)氧能夠誘導(dǎo)mTOR的失活，RXR激動劑卻能抑制mTOR失活，對細(xì)胞起到保護(hù)作用，并且這種保護(hù)作用可被RXR拮抗劑所阻斷，說明激動RXR可通過作用mTOR通路抑制心肌細(xì)胞的過度自噬，減輕細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷。以上研究結(jié)果與本實驗結(jié)果相一致，進(jìn)一步支持了本實驗得出的結(jié)論，即肺缺血/再灌注可上調(diào)細(xì)胞自噬的水平，而通過激動RXR可以抑制細(xì)胞自噬通路，從而減輕肺損傷，保護(hù)肺組織。

綜上所述，大鼠肺缺血/再灌注可誘發(fā)過度的細(xì)胞自噬，損傷肺組織；激活RXR可以抑制細(xì)胞自噬通路，進(jìn)而保護(hù)肺組織。本研究為臨床上肺缺血/再灌注損傷的防治機(jī)制提供了科學(xué)理論依據(jù)，同時也為臨床藥物的研究與開發(fā)提供新的作用靶點。