楊開雯， 強(qiáng) 鄭， 靳貝芳， 靳文雨， 劉 昉△

(1桂林醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖教研室， 廣西 桂林 541004; 2信陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院， 河南 信陽 464000)

糖尿病是當(dāng)今威脅人類健康的重大疾病，超過1/3的糖尿病患者已有嚴(yán)重的并發(fā)癥，嚴(yán)重威脅著人類生命安全和生活質(zhì)量。研究表明，合并心血管系統(tǒng)并發(fā)癥的糖尿病患者致死率增加 2 倍以上[1],其中糖尿病心肌損傷是糖尿病心血管并發(fā)癥的重要組成部分。糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM)是獨(dú)立于高血壓、缺血和心臟瓣膜疾病所導(dǎo)致的心臟結(jié)構(gòu)和功能異常的心肌病，最終臨床表現(xiàn)為充血性心力衰竭、心源性休克以及猝死[2]。微小RNA(microRNA，miRNA，miR)是一種長(zhǎng)度為18～25個(gè)核苷酸的小分子，通過調(diào)節(jié)目標(biāo)信使RNA來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄基因的表達(dá)。有數(shù)據(jù)顯示，miRNAs參與30%～50%基因的表達(dá)調(diào)控[3-4]。近年來的研究顯示心臟高豐度表達(dá)的miRNAs在各種心臟病的發(fā)病機(jī)制中扮演著重要角色。miR-146家族有miR-146a和miR-146b 2種，分別位于不同的染色體，在3’端“非種子區(qū)”有2個(gè)堿基不同。本研究擬探討miR-146a和miR-146b在糖尿病導(dǎo)致的心肌損傷過程中的調(diào)控作用，以及其下游靶基因免疫調(diào)節(jié)相關(guān)分子TNF受體相關(guān)因子6(TNF receptor-associated factor 6，TRAF6)和白細(xì)胞介素1受體相關(guān)激酶1(interleukin-1 receptor-associated kinase 1，IRAK1)在糖尿病心肌損傷中表達(dá)情況，試圖從miRNAs的角度尋找新的糖尿病心肌病變的發(fā)病機(jī)制和治療方案。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物分組與處理

SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠60 只，體質(zhì)量約(19.00±3.67)g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)為 SCXK(湘)2016-0002。所有實(shí)驗(yàn)小鼠在桂林醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心適應(yīng)性喂養(yǎng) 1周后，隨機(jī)分為對(duì)照(control)組和糖尿病心肌病(DCM)組,每組30只，其中DCM組小鼠采用10 mmol/L鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ，Sigma-Aldrich)連續(xù)5 d腹腔注射并且給予高脂高糖飲食喂養(yǎng)制作1型糖尿病模型，注射劑量為50 mg/kg； control 組則注射同等劑量的枸櫞酸鈉緩沖液。注射1周后，尾靜脈取血測(cè)量各組血糖水平。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)，嚙齒類動(dòng)物血漿葡萄糖濃度>16.7 mmol/L可認(rèn)為糖尿病模型造模成功。每周監(jiān)測(cè)隨機(jī)血糖和體質(zhì)量，并密切觀察所有小鼠的基本情況。造模成功后 12 周末，對(duì)小鼠進(jìn)行1次性腹腔注射 3%戊巴比妥鈉麻醉，開胸取出心臟，一部分做成蠟塊用于石蠟切片，另外一部分保存于-80 ℃冰箱中，用于后續(xù)的RT-qPCR及Western blot檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。

2 方法

2.1HE和Masson染色 (1)HE染色：石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟，依次梯度乙醇水化；蘇木素液染色 5 min 后，流水沖洗 1～3 min；然后加 1%鹽酸乙醇 2 s，流水沖洗 3～5 min；伊紅染液復(fù)染 30 s 后脫水；最后用中性樹膠封片； (2)Masson染色切片脫蠟至水，Masson 復(fù)合染液滴染 2 min，0.2%冰醋酸洗 3 次，共 1 min；0.1%磷鎢酸分化 4 min，0.2%冰醋酸溶液洗 3 次，共1 min；亮綠染液染 1 min，0.2%冰醋酸洗 3 次，共 1 min，95%乙醇脫水 1 min，無水乙醇脫水 1 min，環(huán)保透明劑浸泡 5 min，最后用中性樹膠封片； (3)圖像分析：采用生物顯微鏡軟件拍照，心肌細(xì)胞呈紅色，膠原纖維呈藍(lán)色條索狀或均質(zhì)結(jié)構(gòu)，位于細(xì)胞間隙。采用ImageJ程序軟件進(jìn)行圖像分析，膠原纖維染色面積占組織切片總面積的比例為膠原容積分?jǐn)?shù)(collagen volume fraction，CVF)。

2.2RT-qPCR檢測(cè)miR-146a和miR-146b及心房利鈉肽(atrial natriuretic peptide，ANP)、β-肌球蛋白重鏈(β-myosin heavy chain，β-MHC)、IRAK1和TRAF6 mRNA的表達(dá) 從-80 ℃冰箱中取出保存的約 50 mg 小鼠心肌組織，按照 TRIzol(Invitrogen)法提取 RNA，用 NanoDrop 2000 分光光度儀(NanoDrop)檢測(cè) RNA 純度和濃度。以 RNA 為模板，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TOYOBO)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄， 利用SYBR? Green Real-time PCR Master Mix 試劑盒(TOYOBO)檢測(cè)miR-146a和miR-146b的表達(dá)水平及ANP、β-MHC、IRAK1和TRAF6 的mRNA 表達(dá)水平，其中， miR-146a和miR-146b以U6為內(nèi)參照，反轉(zhuǎn)錄引物和PCR擴(kuò)增引物購(gòu)于RiboBio；ANP、β-MHC、 IRAK1及TRAF6以GAPDH為內(nèi)參照，應(yīng)用隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄，PCR引物購(gòu)于Sangon Biotech。各基因引物序列采用 Prmier 3.0設(shè)計(jì),見表1。

表1 RT-qPCR的引物序列

2.3Western blot檢測(cè)小鼠心肌組織中IRAK1及TRAF6的蛋白表達(dá) 將小鼠心臟加入RIPA 裂解液(Santa Cruz)，勻漿、離心后獲得總蛋白。BCA法測(cè)定蛋白濃度后，使用 SDS-PAGE分離，電轉(zhuǎn)印至 PVDF 膜上。5% 脫脂牛奶封閉后，分別加入抗IRAK1 (Cell Signaling Technology)、TRAF6(Abcam)和β-tubulin(Cell Signaling Technology)的I抗，4 ℃孵育12 h；TBST 洗滌后，加入II抗(中杉金橋)，室溫下孵育 60 min，ECL顯色法顯色，X線片曝光檢測(cè)IRAK1和TRAF6的蛋白水平表達(dá)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS 13.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，2組間比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 小鼠代謝指標(biāo)的變化

與control組比較， DCM組小鼠的血糖值穩(wěn)步上升，并趨于穩(wěn)定在高血糖范圍(P=0.0011)，見圖1A；DCM組小鼠體重在建模早期與control組無明顯差異，8周后呈現(xiàn)明顯下降趨勢(shì)(P=0.0039),見圖1B；DCM組小鼠心臟重量與control組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖1C。我們進(jìn)一步檢測(cè)了心肌肥大的標(biāo)志性因子ANP和β-MHC的mRNA表達(dá)情況，結(jié)果顯示與control組相比，DCM組小鼠心肌組織中的ANP及β-MHC的mRNA水平顯著升高(P<0.05或P<0.01)，見圖2。

Figure 1.Blood glucose (A), body weight (B) and heart weight (C) in control group and DCM group. Mean±SD. n=6. *P<0.05, **P<0.01 vs control group.

Figure 2.The mRNA levels of ANP and β-MHC in the heart of control group and DCM group. Mean±SD. n=6. *P<0.05, **P<0.01 vs control group.

2 小鼠心臟的病理變化

第 12周末小鼠心臟的 HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與control組相比，DCM 組小鼠部分心肌細(xì)胞肥大，心肌結(jié)構(gòu)紊亂，成纖維細(xì)胞明顯增多,見圖3。Masson 染色可見心肌纖維為暗紅色，而膠原纖維為深藍(lán)色，control組小鼠間質(zhì)膠原纖維較少，且主要分布于大血管壁周圍，DCM 組心肌內(nèi)血管壁周圍膠原纖維增多，在心肌細(xì)胞間隙內(nèi)也出現(xiàn)大量膠原纖維，DCM組CVF較control組顯著升高(P=0.0257),見圖4。

3 小鼠心肌組織中miR-146的表達(dá)

RT-qPCR檢測(cè)miR-146a及miR-146b的水平,結(jié)果表明，與control組相比，DCM組小鼠心肌組織中miR-146a及miR-146b的表達(dá)均顯著減少(P<0.01),見圖5。

Figure 3.The cardiac pathological changes of control group and DCM group observed by HE staining (×20).

4 TRAF6及IRAK1 mRNA和蛋白表達(dá)的變化

RT-qPCR結(jié)果顯示，與control組相比，DCM組TRAF6的mRNA表達(dá)顯著降低，而IRAK1的mRNA表達(dá)顯著增高(P<0.01或P<0.05),見圖6。Western blot 檢測(cè)TRAF6和IRAK1的蛋白表達(dá)水平與mRNA水平的變化趨勢(shì)一致，與control組相比，DCM組小鼠心臟的TRAF6蛋白表達(dá)顯著降低，IRAK1的蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05)，見圖7。

Figure 4.The cardiac pathological changes of control group and DCM group observed by Masson staining (×20). Mean±SD. n=6. * P<0.05 vs control group.

討 論

在目前的研究中，STZ常用于破壞胰腺細(xì)胞，構(gòu)建糖尿病模型，這種實(shí)驗(yàn)性糖尿病模型能夠在很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定，死亡率較低[5]；此外，這種模型在短時(shí)間內(nèi)很容易誘發(fā)1型糖尿病，與非肥胖糖尿病患者[6]的糖尿病非常相似。在本研究中，空腹血糖的研究結(jié)果與之前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[7-8]，并證實(shí)了1型糖尿病的誘導(dǎo)成功。另外心肌細(xì)胞肥大相關(guān)基因ANP和β-MHC的mRNA表達(dá)顯著升高，符合體外研究動(dòng)物糖尿病心肌病早期心肌細(xì)胞肥大的病理特征及心肌病理變化的動(dòng)態(tài)過程[9]，說明糖尿病實(shí)驗(yàn)組小鼠心臟出現(xiàn)了心肌肥大等糖尿病心肌損傷的典型癥狀。

Figure 5.The expression of miR-146a and miR-146b in the heart of control group and DCM group detected by RT-qPCR. Mean±SD. n=6. ** P<0.01 vs control group.

Figure 6.The mRNA levels of TRAF6 and IRAK1 in the mouse myocardium of control group and DCM group. Mean±SD. n=6. *P<0.05, **P<0.01 vs control group.

非編碼RNA尤其是miRNAs是轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)的主要調(diào)控因子，多數(shù)情況下與信使RNA的3’-UTR結(jié)合，通過降解信使RNA或抑制轉(zhuǎn)錄從而調(diào)控基因的表達(dá)[10]，一些特殊的miRNAs參與糖尿病的慢性并發(fā)癥[11-14]，如在先前的研究中，miR-146a在糖尿病腎[15]和糖尿病患者[16-17]的血漿和角膜上皮組織表達(dá)增加，在糖尿病大鼠的主動(dòng)脈和坐骨神經(jīng)[18-19]中表達(dá)下調(diào)；miRNA-146b在人和小鼠的心肌炎[20]和自發(fā)性心肌肥大和心衰小鼠[21]的心臟中表達(dá)上調(diào)。

Figure 7.The protein levels of TRAF6 and IRAK1 in the mouse myocardium of control group and DCM group. Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs control group.

2型糖尿病與慢性低水平炎癥的相關(guān)性具有典型性，miR-146在2型糖尿病患者血清中表達(dá)減少被認(rèn)為是慢性炎癥的標(biāo)志[22]。但是在1型糖尿病中，根據(jù)胰腺組織的損傷情況來看，這種炎癥反應(yīng)很可能也存在于1型糖尿病中[23-25]。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，TRAF6和IRAK1為miR-146的靶基因[26]，miR-146可以通過結(jié)合下游靶基因特定的3’-UTR來調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，而且TRAF6和IRAK1是炎癥調(diào)控相關(guān)因子，在糖尿病心肌病的發(fā)病過程中也可能起重要作用。本研究中，糖尿病實(shí)驗(yàn)組小鼠心臟中的miR-146a和miR-146b表達(dá)均顯著降低，這很可能是1型糖尿病小鼠心臟出現(xiàn)慢性炎癥的一個(gè)標(biāo)志。本實(shí)驗(yàn)中，糖尿病實(shí)驗(yàn)組小鼠心肌組織中TRAF6表達(dá)較control組顯著降低，而IRAK1的表達(dá)顯著升高。IRAK1為白細(xì)胞介素受體相關(guān)激酶，是促炎癥因子，也是TLR/IL1R炎癥信號(hào)通路的主要介質(zhì)，參與IL-1誘導(dǎo)的NF-κB上調(diào)調(diào)控通路，在吳鏗等[27]的研究中， DCM能上調(diào)TLR4表達(dá)。本研究中，糖尿病心肌病小鼠miR-146表達(dá)降低，而IRAK1的表達(dá)明顯升高，因此在糖尿病心肌病小鼠心肌組織中miR-146對(duì)IRAK1可能也存在負(fù)調(diào)控作用。也有報(bào)道顯示miR-146可以通過抑制Toll樣受體(Toll-like receptors，TLR)信號(hào)通路調(diào)節(jié)Th1[28]細(xì)胞以應(yīng)對(duì)炎癥刺激。TRAF6也是NF-κB信號(hào)通路中的轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，但是在本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中TRAF6的表達(dá)水平降低，這可能與炎癥反應(yīng)調(diào)控的時(shí)點(diǎn)有關(guān)，這提示，在心臟中miR-146可能只調(diào)控IRAK1的表達(dá)，TRAF6可能受到其它miRNAs的負(fù)向調(diào)控。在有關(guān)干燥綜合征的研究中，miR-146也只是負(fù)反饋調(diào)節(jié)IRAK1，對(duì)TRAF6的調(diào)控不明顯[29]，這與我們的研究結(jié)果類似。 關(guān)于糖尿病心肌病的炎癥網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制還有待深入研究。

總之，目前的研究結(jié)果表明miR-146參與糖尿病心肌病的發(fā)生發(fā)展，另外，在2型糖尿病中，miR-146被認(rèn)為是炎癥反應(yīng)的血清標(biāo)志物，這也顯示了miR-146及其下游信號(hào)導(dǎo)致糖尿病的慢性炎癥和胰島素抵抗。細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物模型表達(dá)的研究，將有助于確定miR-146的確切作用，以及它與糖尿病炎癥和胰島素抵抗的相關(guān)性。血清可檢測(cè)到的microRNA可能為疾病檢測(cè)、監(jiān)測(cè)和個(gè)性化藥物提供一種潛在的非侵入性措施。未來的研究將證明，在增強(qiáng)miR-146表達(dá)或調(diào)節(jié)miR-146信號(hào)時(shí)，能夠改變糖尿病心肌病變中炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，減少炎癥和胰島素敏感性的作用，以防止糖尿病心臟發(fā)生炎癥變化。