李艷莉， 鄧金勇， 王金齡， 何升騰

(1海南省第三人民醫(yī)院口腔科， 2三亞市人民醫(yī)院口腔科， 海南 三亞 572000)

口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是頭頸部的最常見腫瘤之一，約占口腔腫瘤的90%[1]。 在美國，OSCC每年新發(fā)病例約4萬例，每年死亡8 000例，5年生存率約為50%[2]。 盡管手術治療和化療已被用于OSCC的治療，但缺乏早期發(fā)現(xiàn)OSCC標志物和現(xiàn)有藥物治療對部分病人沒有效果仍然是OSCC治療的一大挑戰(zhàn) 。 另外，OSCC發(fā)生及發(fā)展的分子機制尚不清楚。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是大于200 bp且不具有蛋白編碼能力的轉錄物，lncRNA在細胞染色質重塑、轉錄、轉錄后處理、細胞內(nèi)運輸?shù)裙δ芷鹬匾淖饔肹3-4]。此外，許多研究還顯示lncRNA的表達失調與各種類型腫瘤的進展有關。最新的研究發(fā)現(xiàn)lncRNA PCAT1的上調與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系，包括前列腺癌、肝癌、膀胱癌、乳腺癌等[5-8]，但PCAT1在OSCC中的作用尚未有報道。本研究通過一系列體外實驗研究了 PCAT1對OSCC細胞增殖、生長、侵襲、遷移及上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的作用，并探討其潛在的機制。

材 料 和 方 法

1 主要材料

正常人口腔黏膜角質細胞(normal human oral keratinocyte,NHOK)及OSCC細胞系SCC-25、Tca8113和TSCCa購于ATCC；DMEM/F12培養(yǎng)液和胎牛血清購于Thermo Fisher Scientific；PCAT1小干擾RNA(PCAT1 small interfence, PCAT1 siRNA；序列為5’-GCACCTTGTTAGCTACATAAA-3’)、陰性對照干擾RNA(control siRNA;序列為5’-GACAGCTTATATGACCACTTA-3’)及實時熒光定量PCR 的引物均購于廣州瑞博生物科技有限公司； TRIzol試劑、cDNA Synthesis Kit 和Lipofectamine 2000購于Invitrogen；實時熒光定量PCR試劑盒購于TaKaRa；Western blot相關抗體購于Abcam；CCK-8試劑盒購于北京碧云天公司。

2 主要方法

2.1組織來源 本實驗所用的20對口腔癌臨床組織來自海南省第三人民醫(yī)院病理科，所有組織標本經(jīng)病理醫(yī)生確診。本研究經(jīng)過海南省第三人民醫(yī)院倫理委員會批準，所有患者知情同意。

2.2細胞培養(yǎng)與細胞轉染 NHOK及OSCC細胞系(SCC-25、Tca8113及TSCCa)用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2的濕潤培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當6孔板里每孔細胞數(shù)量達2×105時，用不含雙抗的培養(yǎng)液培養(yǎng), 當細胞融合率達80%時采用Lipofectamine 2000試劑盒進行轉染, 轉染后24 h收集細胞進行相關實驗。

2.3RT-qPCR 使用TRIzol試劑從OSCC腫瘤組織和細胞中分離總RNA，并逆轉錄為cDNA。 在RNA逆轉錄后， 使用SYBR Premix Ex Taq在采用熒光定量PCR 儀擴增檢測相關基因的表達水平。GAPDH作為內(nèi)參照。采用2-ΔΔCt方法分析結果，每組設3個復孔，實驗重復3次，引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列

2.4CCK-8實驗 取對數(shù)生長期的細胞以每孔1×104接種在96孔板中預培養(yǎng)24 h，然后將細胞分別轉染control siRNA和PCAT1 siRNA，于轉染完成后0 h、24 h、48 h和72 h分別加 入 CCK-8試劑，37 ℃孵育3 h ，酶聯(lián)免疫檢測儀于450 nm波長處檢測吸光度(A)值。

2.5集落形成實驗 將轉染后的細胞以每孔500個細胞接種于6孔板中。14 d后，細胞用甲醇固定，用0.1%結晶紫染色， 顯微鏡下計數(shù)可見集落。

2.6細胞侵襲以及遷移實驗 將無血清培養(yǎng)基中的轉染的OSCC細胞(1×105)加入預先包被Matrigel(用于侵襲實驗；無Matrigel用于細胞遷移試驗)的插入孔(8 μm孔徑)。 同時，將500 μL含有10% 胎牛血清的DMEM 加入下腔 室中。 孵育48 h后，取出插入孔，棄去孔中培養(yǎng)液，利用PBS浸洗3次。將小室利用甲醇固定30 min，適當風干，0.1%結晶紫染色20 min，用棉簽輕輕擦掉上層未侵襲和遷移細胞，用PBS洗3次，最后顯微鏡下隨機選取5個視野觀察細胞，計數(shù)。

2.7Western blot實驗 使用蛋白提取試劑盒進行總蛋白提取，通過SDS-PAGE凝膠電泳分離，然后將分離的蛋白轉移到PVDF膜。 將PVDF膜 分別與不同的 I 抗(ZEB1 1 ∶1 500, N-cadherin 1∶1 000, vi-mentin, E-cadherin 1∶1 000， β-actin 1∶ 2 000)于4 ℃孵育過夜，PBS洗滌3次，每次15 min，然后與辣根過氧化物酶結合的II抗室溫孵育1 h。利用TBST洗滌3次后進行曝光顯影，用凝膠成像儀測量各顯色條帶的灰度值。

3 統(tǒng)計學處理

所有統(tǒng)計分析均使用SPSS 16.0和GraphPad Prism 6.0軟件進行。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。組間比較使用獨立樣品t檢驗或單因素方差分析(one-way ANOVA)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學顯著性。

結 果

1 PCAT1 在OSCC表達上調

通過RT-qPCR檢測了OSCC組織以及癌旁正常組織中的 PCAT1 的表達水平，實驗結果顯示，與癌旁正?？谇唤M織相比，PCAT1在OSCC 組織中表達上調(P<0.05)，見圖1A；RT-qPCR檢測了不同OSCC細胞系以及正?？谇患毎つそ琴|細胞中的PCAT1的表達水平，實驗結果顯示，與NHOK組相比，PCAT1在3種不同的OSCC細胞系(SCC-25、Tca8113及TSCCa)中的表達都上調(P<0.05)，見圖1B。為了進一步研究PCAT1表達水平對 OSCC細胞行為的影響，將Tca8113和TSCCa細胞分別轉染PCAT1 siRNA和control siRNA，RT-qPCR結果顯示，與control組相比，轉染了PCAT1 siRNA的Tca8113細胞及 TSCCa細胞PCAT1的表達水平都顯著降低(P<0.05)，見圖1C、D。

Figure 1. The expression of PCAT1 in the OSCC tissues and cells was up-regulated. A: the expression of PCAT1 in OSCC tissues and adjacent noncancerous tissues was detected by RT-qPCR; B: the expression of PCAT1 in normal human oral keratinocytes (NHOK) and OSCC cells was detected by RT-qPCR; C: the expression of PCAT1 in Tca8113 cells transfected with control siRNA and PCAT1 siRNA was detected by RT-qPCR; D: the expression of PCAT1 in TSCCa cells transfected with control siRNA and PCAT1 siRNA was detected by RT-qPCR. Mean±SD. n=3.#P<0.05 vs non-cancerous group; △P<0.05, △△ P<0.01 vs NHOK group; * P<0.05, ** P<0.01 vs control group.

2 PCAT1 沉默對OSCC細胞增殖的影響

通過CCK-8和集落形成實驗分別檢測OSCC細胞的增殖。CCK-8實驗結果顯示，PCAT1 siRNA的轉染可顯著抑制Tca8113和TSCCa細胞的活力(P<0.05)，見圖2A、B。集落形成實驗結果顯示，沉默Tca8113和TSCCa細胞中PCAT1表達可以減少Tca8113及TSCCa細胞的集落形成數(shù)量(P<0.05)，見圖2C、D。

Figure 2.Silencing of PCAT1 inhibited OSCC cell proliferation. A: the viability of Tca8113 cells transfected with control siRNA or PCAT1 siRNA was measured by CCK-8 assay; B: the viability of TSCCa cells transfected with control siRNA or PCAT1 siRNA was measured by CCK-8 assay; C: the growth of Tca8113 cells transfected with control siRNA or PCAT1 siRNA was detect by colony formation assay; D: the growth of TSCCa cells transfected with control siRNA or PCAT1 siRNA was detected by colony formation assay. The scale bar=5 mm. Mean±SD. n=3.*P<0.05, ** P<0.01 vs control siRNA group.

3 PCAT1沉默對OSCC細胞的侵襲和遷移的影響

通過細胞侵襲及遷移實驗分別檢測OSCC細胞的侵襲及遷移能力。細胞侵襲實驗結果顯示， PCAT1 siRNA的轉染能夠抑制Tca8113及TSCCa細胞的侵襲數(shù)量(P<0.05)，見圖3A、B。細胞遷移實驗結果顯示，沉默Tca8113及TSCCa細胞的PCAT1表達可以抑制Tca8113及TSCCa細胞的遷移數(shù)量(P<0.05)，見圖3C、D。

4 PCAT1沉默對OSCC細胞上皮間質轉化的影響

通過光學顯微鏡觀察沉默PCAT1對 OSCC細胞的形態(tài)影響，結果顯示轉染PCAT1 siRNA的OSCC細胞一部分由紡錘形變成不規(guī)則多邊形或圓形, 但變化不是非常明顯，見圖4A、B。通過檢測EMT相關基因的表達水平來探討PCAT1沉默對OSCC細胞 EMT的影響，RT-qPCR 結果顯示PCAT1 siRNA的轉染能夠抑制Tsa8113及TSCCa細胞中的ZEB1、 N-cadherin和vimentin的mRNA表達，同時提高E-cadherin的表達水平(P<0.05)，見圖4C、D。 進一步的Western blot 結果顯示PCAT1 siRNA的轉染能夠降低Tca8113及TSCCa細胞中的ZEB1、 N-cadherin和vimentin 的蛋白水平，同時提高E-cadherin的蛋白水平(P<0.05)，見圖4E、F。

討 論

基因組學和轉錄組學的快速發(fā)展突出了非編碼RNA在人類腫瘤中的重要作用。 lncRNA是長度超過200個核苷酸且沒有蛋白質翻譯功能的RNA分子。 據(jù)報道，lncRNA在多種細胞過程中起重要作用，如細胞生長、細胞凋亡、遷移，侵襲和自噬[9]。雖然已經(jīng)報道了多種lncRNA調節(jié)腫瘤發(fā)生和轉移，但是lncRNA在OSCC中的功能作用仍然很大程度上是未知的。本研究發(fā)現(xiàn)PCAT1在OSCC 細胞中表達上調，沉默PCAT1在 OSCC的表達能夠抑制OSCC細胞的增殖、生長、侵襲及遷移，并且抑制OSCC的EMT。

Figure 3.Silencing of PCAT1 inhibited OSCC cell invasion and migration. A: the invasion of Tca8113 cells transfected with control siRNA or PCAT1 siRNA was determined by cell invasion assay; B: the invasion of TSCCa cells transfected with control siRNA or PCAT1 siRNA was determined by cell invasion assay; C: the migration of Tca8113 cells transfected with control siRNA or PCAT1 siRNA was determined by cell migration assay; D: the migration of TSCCa cells transfected with control siRNA or PCAT1 siRNA was determined by cell migration assay. Mean±SD. n=3.* P<0.05, ** P<0.01 vs control siRNA group.

研究發(fā)現(xiàn)不同的lncRNAs通過不同的分子機制來調控OSCC的發(fā)生以及發(fā)展。Fang等[10]研究發(fā)現(xiàn) lncRNA UCA1通過抑制miR-184的表達來促進OSCC細胞的增殖和順鉑耐藥性。Liu等[11]發(fā)現(xiàn)lncRNA MEG3通過調控WNT/β-catenin信號通路抑制OSCC細胞的增殖和轉移 。也有研究發(fā)現(xiàn)lncRNA HOTAIR通過招募EZH2以及抑制E-cadherin 促進OSCC細胞侵襲和轉移[12]。最近研究發(fā)現(xiàn)lncRNA PCAT1 在多種腫瘤組織 (包括前列腺癌、肝癌、膀胱癌以及乳腺癌)中表達上調, PCAT1表達上調可以促進包括肝癌、前列腺癌細胞的增殖以及遷移[5-8]。Zhang等[13]研究發(fā)現(xiàn)PCAT1通過靶向調節(jié)miR-129-5p-HMGB1信號通路促進肝癌細胞的侵襲以及轉移。Xu等[8]發(fā)現(xiàn) PCAT1 能夠通過靶向miR-145-5p來調控FSCN1基因從而促進前列腺癌的發(fā)展。Bi等[14]研究發(fā)現(xiàn)PCAT1過表達能夠通過調控CDKN1A基因促進胃癌細胞的增殖以及轉移。Huang等[15]發(fā)現(xiàn)PCAT1可以通過抑制p21的表達水平從而促進骨肉瘤的發(fā)生。 研究的結果與之前的研究一致的發(fā)現(xiàn)PCAT1沉默能夠抑制OSCC細胞的增殖、生長、侵襲及遷移，提示PCAT1對OSCC的發(fā)生以及發(fā)展可能起到促進作用。

Figure 4.Silencing of PCAT1 inhibited EMT in OSCC cells. A and B: the morphological changes of Tca8133 and TSCCa cells transfected with control siRNA or PCAT1 siRNA was examined by light microscopy (the scale bar=100 μm); C: the mRNA expression of ZEB1, N-cadherin, vimentin and E-cadherin in Tca8113 cells transfected with control siRNA or PCAT1 siRNA was determined by RT-qPCR; D: the mRNA expression of ZEB1, N-cadherin, vimentin and E-cadherin in TSCCa cells transfected with control siRNA or PCAT1 siRNA was determined by RT-qPCR; E: the protein levels of ZEB1, N-cadherin, vimentin and E-cadherin in Tca8113 cells transfected with control siRNA or PCAT1 siRNA was determined by Western blot; F: the protein levels of ZEB1, N-cadherin, vimentin and E-cadherin in TSCCa cells transfected with control siRNA or PCAT1 siRNA was determined by Western blot. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control siRNA group.

腫瘤轉移是導致大多數(shù)癌癥患者死亡的主要原因。作為惡性腫瘤的主要標志，轉移是一個復雜的過程。EMT是促成腫瘤轉移的最常見的細胞轉移事件之一， 在EMT 的過程中促進細胞間接觸的蛋白質如E-cadherin的表達下調，而間充質標志物，如vimentin和N-cadherin的表達上調[16-17]。Li等[18]研究發(fā)現(xiàn)lncRNA AC132217.4表達上調可以促進OSCC細胞的增殖以及EMT。也有研究發(fā)現(xiàn)lncRNA MALAT1通過誘導上皮間質轉變換來促進OSCC細胞的生長和轉移[19]。本研究進一步實驗發(fā)現(xiàn)PCAT1沉默能夠抑制OSCC細胞N-cadherin和vimentin的表達，同時促進E-cadherin的表達，提示PCAT1沉默能夠抑制OSCC 細胞的EMT。

綜上所述本研究的結果提示沉默PCAT1能夠抑制OSCC細胞的增殖、生長及轉移，PCAT1對OSCC細胞轉移的作用可能與調控EMT有關。本研究僅僅從細胞層面研究了PCAT1對OSCC的作用，將來有必要進一步從體內(nèi)實驗以及臨床研究來進一步確定PCAT1在OSCC的發(fā)生發(fā)展中的重要作用。