王志慧，梁文輝，原志慶，李 娜

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院體檢中心，河南 新鄉(xiāng) 453000)

乳腺癌是女性常見(jiàn)的發(fā)生在乳腺導(dǎo)管上皮的惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率呈逐年上升趨勢(shì)，已成為嚴(yán)重危害婦女身心健康的重要疾病之一[1]。目前，化學(xué)治療是失去手術(shù)治療最佳時(shí)機(jī)的惡性腫瘤患者的首選方案，但化學(xué)治療耐藥的出現(xiàn)是乳腺癌治療失敗和疾病進(jìn)展的主要原因。大多數(shù)實(shí)體瘤具有低氧微環(huán)境，機(jī)體內(nèi)的缺氧環(huán)境是影響化學(xué)治療和放射治療效果的重要因素之一。目前，有關(guān)缺氧誘導(dǎo)化學(xué)治療耐藥的機(jī)制仍未完全明確，新近的研究結(jié)果表明，缺氧會(huì)增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化學(xué)治療藥物的耐受[2]。作者的前期研究表明，缺氧誘導(dǎo)因子-2α(hypoxia inducible factor-2α，HIF-2α)的表達(dá)與多藥耐藥基因1的表達(dá)及乳腺癌多藥耐藥的發(fā)生也有關(guān)[3]。本研究進(jìn)一步采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR)和Western blot等多種方法檢測(cè)HIF-2α在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)，并檢測(cè)缺氧狀態(tài)下乳腺癌細(xì)胞對(duì)化學(xué)治療藥物的敏感性，以闡明HIF-2α在缺氧誘導(dǎo)乳腺癌多藥耐藥中的作用。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器人低轉(zhuǎn)移乳腺癌MCF-7細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存；HIF-2α兔抗人多克隆抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，AnnexinV-異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒(enhanced chemiluminescence，ECL)購(gòu)自上海碧云天生物有限公司，氟尿嘧啶、阿霉素和紫杉醇購(gòu)自美國(guó)Pharmasia公司，CoCl2購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，引物由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成，TRIzol試劑、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和qRT-PCR試劑盒購(gòu)自大連TaKaRa公司；熒光顯微鏡購(gòu)自日本Nikon公司，流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司，Step One熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)與分組將人低轉(zhuǎn)移乳腺癌MCF-7細(xì)胞分為對(duì)照組、常氧組和缺氧組，各組細(xì)胞置于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100 kU·L-1青霉素和 100 mg·L-1鏈霉素的高糖達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基中，放入37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2的恒溫箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h后，常氧組細(xì)胞更換含生理鹽水的培養(yǎng)基；缺氧組細(xì)胞更換含CoCl2的培養(yǎng)基，CoCl2采用生理鹽水稀釋至終濃度為100 μmol·L-1；對(duì)照組細(xì)胞不處理。

1.3qRT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞中HIF-2αmRNA的表達(dá)待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%融合時(shí)，按照TRIzol試劑說(shuō)明書(shū)提取各組細(xì)胞總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)體外反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1條鏈，使用qPCR檢測(cè)各組細(xì)胞中HIF-2α mRNA的表達(dá)水平。HIF-2α上游引物序列為5′-TGAAAACGAGTCCGAAGCC-3′，下游引物序列為5′-GTGGCTGACTTGAGGTTGA-3′。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性30 s，94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。以?xún)?nèi)參磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)mRNA為參照，通過(guò)公式2-ΔΔCt計(jì)算HIF-2α的相對(duì)表達(dá)量，以Ct值表示基因的起始表達(dá)量， HIF-2α mRNA表達(dá)水平的差異以變化倍率表示。

1.4Westernblot檢測(cè)各組細(xì)胞中HIF-2α蛋白的表達(dá)待細(xì)胞長(zhǎng)至70%融合時(shí)，按試劑盒要求提取各組細(xì)胞的總蛋白，總蛋白采用二喹啉甲酸(bicinchonininc acid，BCA)法進(jìn)行定量。蛋白上清經(jīng)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，脫脂牛奶室溫封閉90 min，加入一抗于4 ℃孵育過(guò)夜；TBST洗滌3次，每次10 min；按照ECL試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，X線片曝光、顯影、定影。應(yīng)用Quantity One軟件分析顯色結(jié)果，計(jì)算內(nèi)參條帶與目的條帶的灰度比值。

1.5細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(cellcountingkit-8，CCK8)檢測(cè)人低轉(zhuǎn)移乳腺癌MCF-7細(xì)胞對(duì)化學(xué)治療藥物的敏感性將人低轉(zhuǎn)移乳腺癌MCF-7細(xì)胞在缺氧(缺氧組)和常氧(常氧組)狀態(tài)下培養(yǎng)8 h后，參照氟尿嘧啶、阿霉素和紫杉醇3種化學(xué)治療藥物的血漿高峰濃度[4-5]，分別加入相應(yīng)化學(xué)治療藥物血漿高峰濃度的0.1、1和10倍，每種藥物的不同濃度均設(shè)4個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，加入CCK-8反應(yīng)液，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)1 h，于450 nm 處檢測(cè)吸光度，計(jì)算不同化學(xué)治療藥物處理后常氧組和缺氧組人乳腺癌細(xì)胞MCF-7的存活率，以細(xì)胞存活率為縱軸，藥物濃度對(duì)數(shù)為橫軸作半對(duì)數(shù)圖，按作圖法求出3種化學(xué)治療藥物的半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50)，IC50越大，敏感性越低。細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組吸光度值-空白對(duì)照吸光度值)/(陰性對(duì)照吸光度值-空白對(duì)照吸光度值)×100%。

1.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)缺氧狀態(tài)下人低轉(zhuǎn)移乳腺癌MCF-7細(xì)胞內(nèi)化學(xué)治療藥物的蓄積和潴留常氧組和缺氧組人低轉(zhuǎn)移乳腺癌MCF-7細(xì)胞按照每孔 1×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng) 24 h ，再分別于常氧和缺氧狀態(tài)下繼續(xù)培養(yǎng)8 h，每孔加入終濃度為5 mg·L-1阿霉素，繼續(xù)培養(yǎng)1.5 h；置流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算各組細(xì)胞藥物的泵出率，細(xì)胞內(nèi)藥物的泵出率=(細(xì)胞內(nèi)藥物的蓄積量-細(xì)胞內(nèi)藥物的潴留量)/細(xì)胞內(nèi)藥物的蓄積量×100%。

1.7碘化丙啶(propidiumiodide,PI)染色法檢測(cè)缺氧對(duì)化學(xué)治療藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響將人低轉(zhuǎn)移乳腺癌MCF-7細(xì)胞在缺氧(缺氧組)和常氧(常氧組)狀態(tài)下處理8 h，加入終濃度為10倍血漿高峰濃度的阿霉素[5]，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集常氧組和缺氧組細(xì)胞，加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕垂懸細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC輕輕混勻，加入10 μL PI染色液，輕輕混勻，室溫孵育20 min后在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算各組細(xì)胞相應(yīng)的凋亡指數(shù)，凋亡指數(shù)=(早期凋亡細(xì)胞數(shù)+晚期凋亡細(xì)胞數(shù))/細(xì)胞總數(shù)×100%。

2 結(jié)果

2.1各組人低轉(zhuǎn)移乳腺癌MCF-7細(xì)胞中HIF-2αmRNA表達(dá)比較對(duì)照組、常氧組和缺氧組人低轉(zhuǎn)移乳腺癌MCF-7細(xì)胞中HIF-2α mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.717±0.212、0.928±0.215、1.421±0.322，3組細(xì)胞中HIF-2α mRNA相對(duì)表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3.249，P<0.05)；缺氧組人低轉(zhuǎn)移乳腺癌MCF-7細(xì)胞中HIF-2α mRNA相對(duì)表達(dá)量高于常氧組和對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。常氧組與對(duì)照組人低轉(zhuǎn)移乳腺癌MCF-7細(xì)胞中HIF-2α mRNA相對(duì)表達(dá)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2各組人低轉(zhuǎn)移乳腺癌MCF-7細(xì)胞中HIF-2α蛋白表達(dá)比較對(duì)照組、常氧組和缺氧組乳腺癌細(xì)胞MCF-7中HIF-2α蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.637±0.055、0.559±0.008、1.693±0.029，缺氧組人低轉(zhuǎn)移乳腺癌MCF-7細(xì)胞中HIF-2α蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著高于常氧組和對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.623，P<0.05)；常氧組與對(duì)照組人低轉(zhuǎn)移乳腺癌MCF-7細(xì)胞中HIF-2α蛋白相對(duì)表達(dá)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；見(jiàn)圖1。

1:對(duì)照組；2：常氧組；3：缺氧組。

圖1缺氧24h后各組MCF-7細(xì)胞中HIF-2α蛋白的表達(dá)情況(Westernblot)

FigExpressionofHIF-2αproteininMCF-7cellsafterhypoxiafor24hineachgroup(Westernblot)

2.3缺氧組和常氧組人低轉(zhuǎn)移乳腺癌MCF-7細(xì)胞對(duì)化學(xué)治療藥物敏感性比較結(jié)果見(jiàn)表1。缺氧組紫杉醇、阿霉素及氟尿嘧啶的IC50顯著高于常氧組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.942、16.083、18.413，P<0.05)。

表1 常氧組和缺氧組紫杉醇、阿霉素及氟尿嘧啶的IC50比較

注：與常氧組比較aP<0.05。

2.4化學(xué)治療藥物在缺氧組和常氧組人低轉(zhuǎn)移乳腺癌MCF-7細(xì)胞內(nèi)蓄積和潴留的比較結(jié)果見(jiàn)表2。與常氧組比較，缺氧組人低轉(zhuǎn)移乳腺癌MCF-7細(xì)胞內(nèi)阿霉素的蓄積和潴留顯著降低(t=4.664、12.416，P<0.05)，藥物泵出率顯著增高(t=3.984，P<0.05)。

表2 化學(xué)治療藥物在常氧組和缺氧組MCF-7細(xì)胞內(nèi)蓄積、潴留和泵出率比較

注：與常氧組比較aP<0.05。

2.5化學(xué)治療藥物誘導(dǎo)缺氧組和常氧組人低轉(zhuǎn)移乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡的比較結(jié)果見(jiàn)圖2。未經(jīng)阿霉素誘導(dǎo)，常氧組和缺氧組人低轉(zhuǎn)移乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡指數(shù)分別為(7.30±0.42)%和(6.20±0.55)%，2組細(xì)胞凋亡指數(shù)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.713,P>0.05)。阿霉素誘導(dǎo)下，缺氧組和常氧組人低轉(zhuǎn)移乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡指數(shù)分別為(68.50±0.93)%和(93.50±0.65)%，缺氧組人低轉(zhuǎn)移乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡指數(shù)低于常氧組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=35.062,P<0.05)。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)常氧和缺氧狀態(tài)下阿霉素誘導(dǎo)人低轉(zhuǎn)移乳腺癌MCF-7細(xì)胞的凋亡情況

3 討論

乳腺癌是嚴(yán)重威脅婦女健康的重大疾病，近年來(lái)發(fā)病率逐年上升。乳腺癌的治療仍以外科手術(shù)為主，對(duì)于中晚期患者，以阿霉素等為基礎(chǔ)的化學(xué)治療方案成為常用的輔助治療手段；然而，化學(xué)治療失敗并導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)的主要原因與腫瘤細(xì)胞內(nèi)在耐藥或獲得性耐藥有關(guān)[6]。目前，對(duì)于乳腺癌的多藥耐藥尚未找到有效的解決辦法。多藥耐藥的發(fā)生機(jī)制非常復(fù)雜，主要包括多藥耐藥相關(guān)蛋白如乳腺癌耐藥蛋白和P-糖蛋白等的過(guò)度表達(dá)；另外，抗凋亡基因c-myc和Bcl-2等過(guò)度表達(dá)，細(xì)胞內(nèi)酶系統(tǒng)如谷胺酰轉(zhuǎn)肽酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶等異常以及細(xì)胞修復(fù)系統(tǒng)增強(qiáng)都有可能引起細(xì)胞發(fā)生多藥耐藥[7-8]。

腫瘤的多藥耐藥是臨床新輔助化學(xué)治療遇到的主要難題，是許多化學(xué)治療方案失敗的主要原因之一。研究發(fā)現(xiàn)，在缺氧條件下腫瘤細(xì)胞對(duì)阿霉素等化學(xué)治療藥物產(chǎn)生了不同程度的耐藥性[9-10]。缺氧的喉癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇、阿霉素、氟尿嘧啶、順鉑和吉西他濱的敏感性顯著上調(diào)[11]。缺氧增加了胰腺癌細(xì)胞抵抗二氟脫氧胞嘧啶核苷誘導(dǎo)凋亡的能力[12]。而CoCl2誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞缺氧，能夠增加神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)卡莫司汀的抵抗能力[13]。

本課題組前期對(duì)HIF-2α與乳腺癌細(xì)胞多藥耐藥關(guān)系的研究中得知，缺氧狀態(tài)下HIF-2α表達(dá)增加，增加了細(xì)胞內(nèi)多藥耐藥基因的表達(dá)，使乳腺癌細(xì)胞出現(xiàn)了以基因水平改變?yōu)榛A(chǔ)的獲得性耐藥[3]，但低氧微環(huán)境引起腫瘤細(xì)胞對(duì)化學(xué)治療藥物耐藥的機(jī)制尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，CoCl2誘導(dǎo)人低轉(zhuǎn)移乳腺癌MCF-7細(xì)胞缺氧后，顯著降低了細(xì)胞對(duì)紫杉醇、阿霉素、氟尿嘧啶等藥物的敏感性。Annexin V/PI染色法檢測(cè)缺氧狀態(tài)下化學(xué)治療藥物誘導(dǎo)人低轉(zhuǎn)移乳腺癌MCF-7細(xì)胞的凋亡情況，結(jié)果顯示，缺氧降低了化學(xué)治療藥物誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞凋亡。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)缺氧狀態(tài)下人低轉(zhuǎn)移乳腺癌MCF-7細(xì)胞內(nèi)化學(xué)治療藥物阿霉素的蓄積和潴留情況，結(jié)果顯示，在人低轉(zhuǎn)移乳腺癌MCF-7細(xì)胞中藥物蓄積和潴留明顯降低，藥物泵出率明顯增高，本研究結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致[14-15]。這一發(fā)現(xiàn)為乳腺癌細(xì)胞多藥耐藥機(jī)制的研究提供了理論基礎(chǔ)和未來(lái)的研究方向。

綜上所述，缺氧是乳腺癌出現(xiàn)多藥耐藥的原因之一，缺氧誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞出現(xiàn)多藥耐藥可能與缺氧狀態(tài)下HIF-2α在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)增加并能夠降低化學(xué)治療藥物的潴留和蓄積有關(guān)；另外，化學(xué)治療藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡減少也可能與其有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為臨床上逆轉(zhuǎn)乳腺癌細(xì)胞多藥耐藥、改善患者預(yù)后提供了新的思路，但其機(jī)制尚不十分清楚，有待于進(jìn)一步研究。