范改煥，禹香菊，趙憲文

(鄭州市第九人民醫(yī)院檢驗科，河南 鄭州 450053)

肺炎支原體是呼吸道感染常見的病原體,也是兒童社區(qū)獲得性肺炎的重要病原體之一[1-2]。研究顯示，肺炎支原體感染是誘發(fā)慢性阻塞性肺疾病和支氣管哮喘的主要因素[3]，目前，肺炎支原體引起呼吸道疾病的確切機(jī)制尚不清楚。黏蛋白是一類主要由黏多糖組成的糖蛋白，在生物體中起潤滑、化學(xué)屏障及細(xì)胞信號通路的作用。臨床研究表明，黏蛋白過表達(dá)可誘導(dǎo)破壞支氣管和肺實質(zhì)結(jié)構(gòu)，是引發(fā)支氣管炎、慢性阻塞性肺疾病等的重要因素[4]。目前，關(guān)于肺炎支原體感染對支氣管上皮細(xì)胞黏蛋白分泌影響的研究尚未見報道。黏蛋白5AC(mucins 5 ac，MUC5AC)和黏蛋白5B(mucins 5 b，MUC5B)是黏蛋白家族的重要成員，本研究通過探討肺炎支原體對支氣管上皮細(xì)胞MUC5AC、MUC5B分泌的影響，旨在為肺炎支原體感染導(dǎo)致呼吸道疾病的病理機(jī)制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1菌株與細(xì)胞肺炎支原體標(biāo)準(zhǔn)菌株購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫，人支氣管上皮細(xì)胞(human bronchial epithelial cell,HBEC)購自上海子實生物科技有限公司。

1.2主要試劑與儀器胸膜炎微生物(pleuropneumonia-like organism,PPLO)液體培養(yǎng)基購自上海廣銳生物科技有限公司，人支氣管上皮細(xì)胞培養(yǎng)基(human tracheo bronchial epithelial cells,BGEM)購自上?？道噬锟萍加邢薰?，總RNA抽提試劑購自美國賽默飛世爾科技公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司，Synergy Brands(SYBR)熒光染料購于美國Sigma公司，二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白質(zhì)檢測試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司，蛋白酶抑制劑購自瑞士羅氏公司，信息轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子 3 (signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)抑制劑IX Cpd188購自北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司，STAT6抑制劑山柰酚購自上海寶曼生物科技有限公司，表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)抑制劑AG1478購自廈門研科生物技術(shù)有限公司，細(xì)胞裂解液購自上海邦奕生物科技有限公司，MUC5B免疫小鼠抗體、MUC5AC、叉頭框蛋白A2(forkhead box protein A2,FOXA2)免疫兔抗體、Alexa Fluor 488標(biāo)記山羊抗小鼠免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)、Alexa Fluor 647標(biāo)記山羊抗兔IgG、IRDye 680RD標(biāo)記驢抗鼠IgG均購自北京奧威亞生物技術(shù)有限公司，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)購自杭州佐正生物科技有限公司，生長因子購自南京金斯瑞生物科技有限公司；激光共聚焦顯微鏡購自德國蔡司股份公司，Odyssey?紅外成像系統(tǒng)購自美國LICOR公司，熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(fluorescence quantitative polymerase chain reaction,FQ-PCR)儀和5424R冷凍離心機(jī)購自德國艾本德公司。

1.3肺炎支原體的培養(yǎng)取肺炎支原體接種于PPLO液體培養(yǎng)基，于37 ℃生物化學(xué)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，肉眼觀察培養(yǎng)液變?yōu)辄S色時，更換培養(yǎng)基繼續(xù)傳代培養(yǎng)。以液體變黃時的最高稀釋度作為顏色改變單位(colour change unit,CCU)，肺炎支原體測量濃度以CCU·L-1為單位，取1×109CCU·L-1肺炎支原體進(jìn)行下一步實驗。

1.4HBEC培養(yǎng)及分組取單層貼壁生長、融合率約為60%的HBEC接種至5 mL含有生長因子的BGEM中，于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合度>80%后，使用2.5 g·L-1胰蛋白酶消化，更換培養(yǎng)液繼續(xù)傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞，按每孔3×105個細(xì)胞接種于6孔板上，并將細(xì)胞分為2組：一組將預(yù)先培養(yǎng)好的肺炎支原體按照感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)為50接入細(xì)胞培養(yǎng)孔中感染細(xì)胞，作為感染組；另一組未接種肺炎支原體，作為對照組。MOI =有感染力的支原體數(shù)/待感染細(xì)胞數(shù)。本研究中MOI由預(yù)實驗確定。

1.5免疫熒光標(biāo)記法檢測HBEC中MUC5B和MUC5AC的表達(dá)取感染組和對照組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h，棄上清液，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)洗滌3次，每次 5 min。40 g·L-1多聚甲醛固定30 min，PBS洗滌。分別加入MUC5B免疫小鼠抗體和MUC5AC免疫兔抗體一抗，放入 37 ℃ 生物化學(xué)培養(yǎng)箱中孵育 2 h，PBS洗滌3次，每次5 min。避光條件下加入Alexa Fluor 488標(biāo)記山羊抗小鼠IgG和Alexa Fluor 647標(biāo)記山羊抗兔IgG，避光孵育1.5 h后，PBS洗滌3次，每次5 min；加入DAPI染核30 min，PBS洗滌3次，每次5 min，加入PBS緩沖液重懸，應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡檢測細(xì)胞中MUC5AC和MUC5B的熒光信號，采用免疫熒光標(biāo)記法觀察感染組和對照組細(xì)胞中MUC5AC和MUC5B的表達(dá)情況。出現(xiàn)綠色熒光信號為MUC5B陽性表達(dá)，紅色熒光信號為MUC5AC陽性表達(dá)。

1.6FQ-PCR檢測2組細(xì)胞中MUC5B、MUC5AC、叉頭框蛋白A2(FOXA2)、STAT3、STAT6、EGFRmRNA表達(dá)收集感染組和對照組對數(shù)生長期細(xì)胞，參照總RNA抽提試劑說明書提取細(xì)胞總RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)體系為：上、下游引物各0.5 μL，cDNA 1 μL，無RNA酶水8 μL，2×SYBR 10 μL，輕彈混勻，放入冷凍離心機(jī)中1 000 r·min-1離心1 min，注意加入反應(yīng)體系時均需置于冰上，2×SYBR于避光條件下加入反應(yīng)體系。反應(yīng)程序：95 ℃ 預(yù)變性3 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸10 s，共35個循環(huán)；末次延伸 5 min。每個樣品設(shè)3個復(fù)孔。以磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GADPH)為內(nèi)參，檢測2組細(xì)胞中MUC5B、MUC5AC、FOXA2、STAT3、STAT6、EGFR的mRNA表達(dá)情況。MUC5B上游引物序列為5′-CTGAATTCGATGGTGGACAGGA-3′，下游引物序列為5′-GAACGACAGTGGTGGCCGGTGA-3′；MUC5AC上游引物序列為5′-GATGGATTGGTGAACAGA-3′，下游引物序列為5′-TTGGCTTGAGATTGGTGGGTA-3′；FOXA2上游引物序列為5′-GATGTCACCGATATACCTT-3′，下游引物序列為5′-GGTACCACCACAGAGACGCG-3′；STAT3上游引物序列為5′-CGTAACGGGTAATAGAGCACTG-3′，下游引物序列為5′-CACACCCGCGTCTTGTATAAAG-3′；STAT6上游引物序列為5′-GGACTTGAAGACACGAGGCG-3′，下游引物序列為5′-CACACTCGATCAATGTGGTGAAAG-3′；EGFR上游引物序列為5′-CTAAGAATCACACCTTGATGTAAAG-3′，下游引物序列為5′-TGCCTCATGAGTGCATGCCGTGTAG-3′；GAPDH上游引物序列為5′-GATTGAGAACGTAGCTAGGGGAA-3′，下游引物序列為5′-ATTGAGCTATATTACCGTTCCACC-3′。結(jié)果以2-ΔΔCt法進(jìn)行計算。

1.7Westernblot法檢測2組細(xì)胞中MUC5B、MUC5AC、FOXA2、磷酸化STAT3(phospho-STAT3，p-STAT3)、磷酸化STAT6(phospho-STAT6，p-STAT6)、磷酸化EGFR(phospho-EGFR，p-EGFR)蛋白表達(dá)收集感染組和對照組對數(shù)生長期細(xì)胞，用含有蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液處理細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白。使用BCA蛋白濃度檢測試劑盒檢測提取蛋白濃度。利用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離目的蛋白，轉(zhuǎn)膜，牛血清白蛋白封膜，4 ℃過夜，PBS洗滌。分別加入PBS稀釋的MUC5B、MUC5AC、FOXA2、STAT3、STAT6、EGFR抗體一抗(稀釋比例1200)，4 ℃孵育過夜，PBS洗滌。分別加入稀釋后的IRDye 680RD標(biāo)記驢抗鼠IgG(稀釋比例110 000)，室溫孵育2 h，PBS洗滌。利用Odyssey?紅外成像系統(tǒng)對膜進(jìn)行掃描，Image-Pro Plus分析2組細(xì)胞中MUC5B、MUC5AC、FOXA2、p-STAT3、p-STAT6、p-EGFR蛋白表達(dá)情況。p-STAT3、p-STAT6、p-EGFR分別為STAT3、STAT6和EGFR的磷酸化形式。

1.8Westernblot法檢測IXCpd188、山柰酚、AG1478預(yù)處理后細(xì)胞中MUC5B、MUC5AC、FOXA2蛋白表達(dá)取對數(shù)生長期HBEC，分別加入STAT3、STAT6、EGFR的抑制劑 IX Cpd188、山柰酚、AG1478各10 μmol，孵育2 h，將細(xì)胞按“1.4項”中方法接種肺炎支原體。同時取“1.4項”中對數(shù)生長期的感染組和對照組細(xì)胞，分別加入PBS進(jìn)行預(yù)處理，繼續(xù)培養(yǎng)16 h后，收集細(xì)胞，采用Western blot法檢測各組細(xì)胞中MUC5B、MUC5AC、FOXA2的表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1感染組與對照組細(xì)胞中MUC5B、MUC5AC、FOXA2表達(dá)水平比較結(jié)果見表1和圖1、圖2。感染組細(xì)胞中MUC5B和MUC5AC熒光信號較對照組明顯增強(qiáng)。FQ-PCR結(jié)果顯示，感染組細(xì)胞中MUC5B、MUC5AC mRNA相對表達(dá)量顯著高于對照組(P<0.05)，F(xiàn)OXA2 mRNA相對表達(dá)量顯著低于對照組(P<0.05)。Western bolt結(jié)果顯示，感染組細(xì)胞中MUC5B和MUC5AC蛋白相對表達(dá)量顯著高于對照組(P<0.05)，F(xiàn)OXA2蛋白相對表達(dá)量顯著低于對照組(P<0.05)。

表1 2組HBEC中MUC5B、MUC5AC及FOXA2 mRNA及蛋白相對表達(dá)量比較

圖1 2組HBEC中MUC5B和MUC5AC表達(dá)情況(免疫熒光法，×100)

圖2 2組HBEC中MUC5B、MUC5AC和FOXA2蛋白的表達(dá)(Western blot)

2.2感染組與對照組細(xì)胞中STAT3、STAT6和EGFR的mRNA及p-STAT3、p-STAT6和p-EGFR蛋白表達(dá)比較結(jié)果見圖3和表2。感染組細(xì)

胞中STAT3、STAT6和EGFR mRNA相對表達(dá)量顯著高于對照組(P<0.05)；感染組細(xì)胞中p-STAT3、p-STAT6和p-EGFR蛋白相對表達(dá)量高于對照組(P<0.05)。

A：p-STAT3、p-STAT6蛋白相對表達(dá)量；B：p-EGFR蛋白相對表達(dá)量。

2.3IXCpd188、山柰酚、AG1478預(yù)處理后各組細(xì)胞中FOXA2、MUC5B和MUC5AC蛋白表達(dá)水平比較結(jié)果見表3和圖4、圖5。感染組及IX Cpd188、山柰酚、AG1478預(yù)處理組細(xì)胞中FOXA2蛋白相對表達(dá)量均顯著低于對照組(P<0.05)，而IX Cpd188、山柰酚、AG1478預(yù)處理組細(xì)胞中FOXA2蛋白相對表達(dá)量均顯著高于感染組(P<0.05)。感染組及IX Cpd188、山柰酚、AG1478預(yù)處理組細(xì)胞中MUC5B蛋白相對表達(dá)量顯著高于對照組(P<0.05)；與感染組比較，IX Cpd188、山柰酚、AG1478預(yù)處理細(xì)胞中MUC5B、MUC5AC蛋白相對表達(dá)量均顯著降低(P<0.05)。

表2 2組HBEC中STAT3、STAT6、EGFR mRNA及p-STAT3、p-STAT6、p-EGF蛋白相對表達(dá)量比較

表3 STAT3、STAT6和EGFR抑制后HBEC中MUC5B、MUC5AC、FOXA2蛋白表達(dá)水平

注：與對照組比較aP<0.05；與感染組比較bP<0.05。

A：對照組；B：感染組；C：IX Cpd188預(yù)處理組；D：山柰酚預(yù)處理組；E：AG1478預(yù)處理組。

A：對照組；B：感染組；C：IX Cpd188預(yù)處理組；D：山柰酚預(yù)處理組；E：AG1478預(yù)處理組。

3 討論

肺炎支原體屬無細(xì)胞壁原核微生物[5]，可存活于無生命培養(yǎng)基中。研究發(fā)現(xiàn)，肺炎支原體不僅可引起呼吸道炎癥，還可導(dǎo)致腦炎、貧血、哮喘等疾病[6]。據(jù)報道，支氣管肺炎及支氣管哮喘患者發(fā)病期間支氣管上皮細(xì)胞黏蛋白分泌異常增加[7-8]。黏蛋白是呼吸道黏液的重要組成部分，其構(gòu)成中包括豐富的絲氨酸和蘇氨酸，通過羥基側(cè)鏈連接形成寡糖，通過二硫鍵進(jìn)行連接，構(gòu)成聚合體，使呼吸道黏液具有黏著特點[9-10]。研究表明，病原體、粉塵、化學(xué)物質(zhì)等刺激呼吸道均可引起呼吸道黏液分泌增多[11-12]。目前，已知的黏蛋白有20多種，根據(jù)其結(jié)構(gòu)差別可大致分為分泌型和膜結(jié)合型，其中MUC5B和MUC5AC屬于上皮細(xì)胞中主要的分泌型黏蛋白[13-14]。檢測肺炎支原體感染后HBEC中MUC5B和MUC5AC的表達(dá)，探討其可能影響機(jī)制，對闡明肺炎支原體感染引起支氣管疾病的病理機(jī)制具有重要意義。

FOXA2是一種轉(zhuǎn)錄因子，其能夠通過綁定DNA調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，在多種內(nèi)臟器官的分化和發(fā)育中發(fā)揮重要作用[15]。 研究表明，支氣管哮喘和支氣管擴(kuò)張等疾病與FOXA2表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)，F(xiàn)OXA2表達(dá)增加能抑制MUC5AC表達(dá)而緩解支氣管上皮細(xì)胞反應(yīng)[16]。因此，推測肺炎支原體引起支氣管上皮細(xì)胞中MUC5B和MUC5AC過表達(dá)的同時，會抑制FOXA2的表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，感染組細(xì)胞中FOXA2 mRNA和蛋白表達(dá)量顯著低于對照組，提示感染組支氣管上皮細(xì)胞中FOXA2轉(zhuǎn)錄和翻譯水平均受到抑制。有研究顯示，c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)-STAT6-FOXA2信號通路對黏蛋白具有調(diào)節(jié)作用，STAT3、STAT6表達(dá)下調(diào)可促進(jìn)FOXA2的表達(dá)，導(dǎo)致 MUC5AC啟動子受到抑制[17-18]。本研究結(jié)果顯示，感染組中STAT3和STAT6的表達(dá)量顯著高于對照組。另外，肺炎支原體脂質(zhì)膜相關(guān)蛋白具有活化STAT3的作用，而活化的STAT3具有促進(jìn)黏蛋白分泌的作用[19-20]。因此，推測肺炎支原體感染HBEC可引起STAT3和STAT6表達(dá)升高，F(xiàn)OXA2表達(dá)降低，促進(jìn)黏蛋白分泌，從而導(dǎo)致呼吸道疾病發(fā)生。

EGFR是一種跨膜蛋白，可與配體結(jié)合激活多種信號通路，促進(jìn)特異基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄[21-22]，包括JAK激酶-STAT3信號途徑和STAT3活化。有報道稱，EGFR對鼻黏膜上皮細(xì)胞中MUC5AC的表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用[23]。文道林等[24]研究發(fā)現(xiàn)，支原體巨噬細(xì)胞活化脂肽-2可通過EGFR及基質(zhì)金屬蛋白酶9表達(dá)量增加誘導(dǎo)呼吸道上皮細(xì)胞分泌MUC5AC。本研究對各組細(xì)胞中EGFR的表達(dá)量進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，與對照組相比，感染組細(xì)胞中EGFR表達(dá)量顯著上升，與MUC5B和MUC5AC表達(dá)量一致。有研究表明，肺炎支原體感染的支氣管上皮細(xì)胞中STAT3表達(dá)量上升是受到EGFR表達(dá)量影響的結(jié)果[24]。為進(jìn)一步證明STAT3、STAT6、EGFR通過FOXA2調(diào)節(jié)黏蛋白的分泌作用，本研究分別利用STAT3、STAT6、EGFR的抑制劑IX Cpd188、山柰酚、 AG1478對感染肺炎支原體的支氣管上皮細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，利用Western blot法檢測FOXA2的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，經(jīng)抑制劑預(yù)處理的支氣管上皮細(xì)胞中FOXA2的表達(dá)量較未處理的感染肺炎支原體的支氣管上皮細(xì)胞均顯著上升，而MUC5B和MUC5AC表達(dá)量顯著下調(diào)，這說明抑制STAT3、STAT6、EGFR表達(dá)能夠抑制肺炎支原體感染引起的支氣管上皮細(xì)胞黏蛋白分泌增加。

本研究利用肺炎支原體感染人支氣管上皮細(xì)胞，分析肺炎支原體對支氣管上皮細(xì)胞黏蛋白的影響，熒光顯微鏡觀察顯示，感染組細(xì)胞中的MUC5B和MUC5AC熒光信號較對照組明顯增強(qiáng)。為進(jìn)一步確認(rèn)，本研究又通過Western blot和FQ-PCR對MUC5B和MUC5AC在支氣管上皮細(xì)胞中的表達(dá)進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，感染組細(xì)胞中MUC5B、MUC5AC mRNA和蛋白表達(dá)量均顯著高于對照組，與熒光顯微鏡觀察結(jié)果一致。本研究結(jié)果證明，肺炎支原體感染會導(dǎo)致支氣管上皮細(xì)胞中黏蛋白異常增加。

綜上所述，本研究證實肺炎支原體感染可能通過促進(jìn)STAT3、STAT6、EGFR表達(dá)上調(diào)，抑制FOXA2表達(dá)，從而導(dǎo)致支氣管上皮細(xì)胞黏蛋白MUC5B和MUC5AC表達(dá)升高，即通過STAT / EGFR-FOXA2信號通路促進(jìn)支氣管上皮細(xì)胞黏蛋白分泌，引發(fā)呼吸道相關(guān)疾病。肺炎支原體致病機(jī)制極其復(fù)雜，且黏蛋白分泌的具體調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚，因此，肺炎支原體調(diào)節(jié)STAT3、STAT6、EGFR表達(dá)的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步探索。