成 力，陳文江，姚 峰，李小慶

(1.陸軍軍醫(yī)大學(xué)附屬第二醫(yī)院心血管內(nèi)科，重慶 400037；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院心血管內(nèi)科，重慶 400010；3.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣東 湛江 524000)

近年來，我國心血管疾病患病率持續(xù)上升，據(jù)有關(guān)調(diào)查報告顯示，目前，我國心血管疾病患者約2.9 億，其中高血壓患者2.7 億，且我國每年因高血壓而死亡的人數(shù)高達200萬[1-2]。由此可見，高血壓已成為我國重大的公共衛(wèi)生問題。原發(fā)性高血壓(essential hypertension，EH)是最常見的慢性非傳染性疾病，也是心血管疾病的重要危險因素之一，其發(fā)病機制與遺傳(單基因遺傳與基因多態(tài)性)、環(huán)境(包括高鹽飲食、吸煙、應(yīng)激等)、神經(jīng)機制(交感神經(jīng)興奮)、激素機制(腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng))、腎臟機制、血管機制(內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、鈣化、炎癥)和胰島素抵抗等有關(guān)[3-6]。研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA(microRNA，miRNA)與EH的發(fā)病機制有關(guān)[7-8]，miR-296-5p、 miR-let-7e、miR-23b、miR-130a、miR-191、miR-451、miR-1246、miR-26a、miRNA-150等[9-13]可能參與EH的發(fā)病機制。有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-505-3p可能通過影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移及血管形成而參與EH的發(fā)病，但其結(jié)果仍存在一定的爭議。因此，本研究旨在探討miRNA-505-3p與EH的發(fā)病機制的關(guān)系，為EH的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來源選擇2014年5～8月于陸軍軍醫(yī)大學(xué)附屬第二醫(yī)院心血管內(nèi)科收治的EH患者作為研究對象，病例納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡>18 歲，并符合EH診斷標(biāo)準(zhǔn)[14]；排除標(biāo)準(zhǔn)：惡性高血壓、嚴(yán)重肝腎功能不全、惡性腫瘤及妊娠或哺乳期婦女。該研究共納入EH患者60例，男35例，女25例；年齡40～70(61.55±1.17)歲；既往史：吸煙史30例，冠狀動脈粥樣硬化性心臟病史21例，糖尿病15例，心房顫動11例；血壓：收縮壓140～186(167.6±8.4)mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，舒張壓65～110(95.7±10.8)mmHg；血清肌酐(92.46±19.24)μmol·L-1，血糖(5.493±0.203)mmol·L-1，總膽固醇(4.358±0.183)mmol·L-1，三酰甘油(1.437±0.087)mmol·L-1，高密度脂蛋白(1.355±0.088)mmol·L-1，低密度脂蛋白(2.956±0.143)mmol·L-1。另選擇同時期陸軍軍醫(yī)大學(xué)附屬第二醫(yī)院心血管內(nèi)科收治的非EH患者作為對照，病例納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡> 18 歲，收縮壓<140 mmHg，舒張壓<90 mmHg；排除標(biāo)準(zhǔn)：嚴(yán)重肝腎功能不全、惡性腫瘤及妊娠或哺乳期婦女。該研究共納入非EH患者60例，男40例，女20例；年齡38～70(58.28±1.64)歲；既往史：吸煙史25例，冠狀動脈粥樣硬化性心臟病史18例，糖尿病10例，心房顫動8例；血壓：收縮壓90～138(105.6±3.1)mmHg，舒張壓50～88(78.5±6.8)mmHg；血清肌酐(79.99±3.21)μmol·L-1，血糖(5.689±0.231)mmol·L-1，總膽固醇(4.647±0.179)mmol·L-1，三酰甘油(1.281±0.071)mmol·L-1，高密度脂蛋白(1.325±0.055)mmol·L-1，低密度脂蛋白(2.572±0.154)mmol·L-1。EH患者與非EH患者的性別、年齡、既往史、血清肌酐、血糖及血脂水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。所有入選者于入院后6 h內(nèi)采集靜脈血2 mL，4 ℃下3 000 r·min-1離心10 min，分離血漿，-80 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2細(xì)胞、試劑與儀器人主動脈平滑肌細(xì)胞(human aortic smooth muscle cells，HASMC)購自美國Sciencell公司，平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)基(smooth muscle cell medium，SMCM)、miRcute miRNA提取分離試劑盒、miRcute增強型miRNA熒光定量檢測試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，TRIzol總RNA抽提試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)試劑盒、細(xì)胞計數(shù)試劑盒-8(cell counting kit-8，CCK-8)、胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)一抗(稀釋比例1600)和二抗(稀釋比例12 000)、內(nèi)參β-actin(稀釋比例11 000)購自蘇州碧云天生物技術(shù)公司，has-miRNA-505-3p的micrON?miRNA mimic和mimic control、轉(zhuǎn)染試劑(ribo FECTTMCP transfection kit)購自廣州銳博生物科技有限公司，酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒購自深圳柏萬森生物科技有限公司；PCR擴增儀購自德國Eppendor公司，LightCycler480II全自動熒光定量PCR儀購自瑞士Roche公司。

1.3實驗方法

1.3.1實時熒光定量PCR檢測EH患者與非EH患者血漿miRNA-505-3p表達入選人群血漿的miRNA提取采用miRcute miRNA提取分離試劑盒，提取的miRNA經(jīng)過其配套miRcute miRNA cDNA第1鏈合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后配合其miRcute miRNA SYBR Green熒光定量檢測試劑盒及試劑盒中的下游引物進行熒光定量驗證。miRNA-505-3p上游引物序列為5′-GCGAGCACCGTCAACACTTG-3′，下游引物序列為5′-TGCAGGGTCTGACTTATT-3′；內(nèi)參U6上游引物序列為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物序列為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。上機條件：94 ℃變性2 min，94 ℃變性20 s，60 ℃退火、延伸34 s；共30個循環(huán)。采用2-ΔCt相對定量方法進行數(shù)據(jù)分析：ΔCt(實驗組)=Ct(實驗組目標(biāo)基因)-Ct(實驗組內(nèi)參基因)；ΔCt(對照組)=Ct(對照組目標(biāo)基因)-Ct(對照組內(nèi)參)。

1.3.2miRNA-505-3p生物信息學(xué)預(yù)測和分析采用targetScan、picTar、RNA22、PITA和miRanda生物信息學(xué)在線軟件預(yù)測miRNA-505-3p的靶基因，初步了解其生物學(xué)功能。在靶基因預(yù)測時，將至少有上述4個在線軟件預(yù)測得到一致結(jié)果的靶基因作為候選基因，達到條件的靶基因主要有36個，包括IGF-1、IGF-1R、MAP3K3、BCL11B、MAP2K4、LRRFIP1、CPEB2、COL3A1、NHEJ1、SON、ZNF292、PBX3、CMIP、SPTY2D1、EYA1、FMR1、CADM1、VAPA、C12orf23、ATP2B1等。從預(yù)測結(jié)果可知，miRNA-505-3p可能主要調(diào)控IGF-1靶基因。因此，本研究將IGF-1作為候選基因進行進一步驗證。

1.3.3ELISA法檢測EH患者與非EH患者血漿IGF-1水平將所獲取的患者血漿按照IGF-1的ELISA試劑盒說明書對血漿中的IGF-1進行檢測，觀察其表達情況，ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線R2值大于0.99。

1.3.4細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組其培養(yǎng)采用配套專用培養(yǎng)基SMCM進行培養(yǎng)、傳代，于培養(yǎng)箱(37 ℃，含體積分?jǐn)?shù)5%CO2和20%O2)中進行培養(yǎng)，采用第4～8代細(xì)胞進行實驗，本實驗主要采用96孔板和6孔板進行實驗。設(shè)置mimic組(轉(zhuǎn)染miRNA-505-3p mimic序列)、mimic對照組(轉(zhuǎn)染mimic對照序列)和空白對照組(不進行轉(zhuǎn)染)，轉(zhuǎn)染步驟：于6孔板接種細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞融合度達到50%～70%時，先同步化6 h，將轉(zhuǎn)染試劑與轉(zhuǎn)染序列進行混合并加入，然后將6孔板置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 72 h，然后收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，用于后續(xù)實驗。

1.3.5實時熒光定量PCR檢測3組HASMC中miRNA-505-3p表達細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的miRNA提取采用miRcute miRNA提取分離試劑盒，提取的miRNA經(jīng)過其配套miRcute miRNA cDNA第1鏈合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后配合其miRcute miRNA SYBR Green熒光定量檢測試劑盒及試劑盒中的下游引物進行熒光定量驗證。miRNA-505-3p上游引物序列為5′-GCGAGCACCGTCAACACTTG-3′，下游引物序列為5′-TGCAGGGTCTGACTTATT-3′；內(nèi)參U6上游引物序列為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物序列為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。所有實驗方法均按照試劑盒說明書進行，上機條件：94 ℃ 變性2 min；PCR循環(huán)中模板94 ℃變性20 s；60 ℃退火、延伸34 s；共30個循環(huán)。本研究采用2-ΔCt相對定量方法進行數(shù)據(jù)分析：ΔCt(實驗組)=Ct(實驗組目標(biāo)基因)-Ct(實驗組內(nèi)參基因)；ΔCt(對照組)=Ct(對照組目標(biāo)基因)-Ct(對照組內(nèi)參)。

1.3.6實時熒光定量PCR檢測3組HASMC中IGF-1mRNA表達用TRIzol總RNA抽提試劑按照說明書提取RNA(RNA吸光度值A(chǔ)260/A280在1.7～2.1)后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將所提取RNA進行反轉(zhuǎn)錄，然后將反轉(zhuǎn)錄所獲取的cDNA模板按照實時熒光定量PCR試劑盒說明書進行熒光定量，其中，95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃擴增、延伸15 s，60 ℃退火30 s，共40個循環(huán)，以磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase,GAPDH)作為內(nèi)參。IGF-1上游引物序列為：GCTGGTGGATGCTCTTCAGT，下游引物序列為：TGTTGGTAGATGGGGGCTGA；GAPDH的上游引物序列為：TGCCCCCATGTTTGTGATG，下游引物序列為：TGTGGTCATGAGCCCTTCC。本研究采用2-ΔCt相對定量方法進行數(shù)據(jù)分析：ΔCt(實驗組)=Ct(實驗組目標(biāo)基因)-Ct(實驗組內(nèi)參基因)；ΔCt(對照組)=Ct(對照組目標(biāo)基因)-Ct(對照組內(nèi)參)。

1.3.7CCK-8檢測3組HASMC活性將細(xì)胞接種于96孔板并轉(zhuǎn)染，當(dāng)細(xì)胞融合度達到30%～50%時先同步化6 h后再進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每孔加入10 μL CCK-8溶液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育2 h，然后在450 nm處測定吸光度。

1.3.8Westernblot法檢測3組HASMC中IGF-1蛋白表達提取轉(zhuǎn)染后72 h的3組細(xì)胞總蛋白，采用二喹啉甲酸法測量其蛋白濃度，繼而進行蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜、IGF-1一抗(稀釋比例1600)孵育、二抗孵育(稀釋比例12 000)、雜交、顯影、曝光，內(nèi)參選用β-actin(稀釋比例11 000)。結(jié)果分析用Image J圖像分析軟件計算條帶灰度值，并以目的條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1EH患者與非EH患者血漿中miRNA-505-3p相對表達量比較EH患者與非EH患者血漿miRNA-505-3p相對表達量分別為0.156 5±0.025 9、0.007 9±0.001 4，EH患者血漿miRNA-505-3p相對表達量顯著高于非EH患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=6.880，P<0.01)。

2.2血漿miRNA-505-3p作為EH標(biāo)志物的ROC曲線分析EH患者和非EH患者血漿miRNA-505-3p的ROC曲線分析結(jié)果見圖1。ROC曲線下面積為0.988 1，95%可信區(qū)間為0.972 4～0.999 0(P<0.01)。

圖1 血漿miRNA-505-3p作為EH標(biāo)志物的 ROC

2.3EH患者與非EH患者血漿中IGF-1水平比較EH患者和非EH患者血漿中IGF-1水平分別為(1 338.03±96.92)、(620.90±23.19)ng·L-1，EH患者血漿中IGF-1水平顯著高于非EH患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.101，P<0.01)。

2.43組HASMC活性比較mimic組、mimic對照組和空白對照組HASMC活性分別為0.679 7±0.032 8、0.471 0±0.024 5和空白對照組0.525 2±0.035 3；mimic組HASMC活性顯著高于mimic對照組和空白對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=6.201、4.610，P<0.05)；mimic對照組與空白對照組HASMC活性比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.432，P>0.05)。

2.53組HASMC中miRNA-505-3p及IGF-1mRNA表達水平比較mimic組、mimic對照組和空白對照組HASMC中miRNA-505-3p相對表達量分別為0.693 3±0.022 9、0.020 6±0.000 8、0.023 8±0.001 1；mimic組HASMC中miRNA-505-3p相對表達量顯著高于mimic對照組和空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.991、5.840，P<0.01)；mimic對照組與空白對照組HASMC中miRNA-505-3p相對表達量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.323，P>0.05)。mimic組、mimic對照組和空白對照組HASMC中IGF-1 mRNA相對表達量分別為0.238 6±0.013 3、0.082 4±0.004 0、0.079 7±0.004 7；mimic組HASMC中IGF-1 mRNA相對表達量顯著高于mimic對照組和空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=16.903、18.240，P<0.01)；mimic對照組與空白對照組HASMC中IGF-1 mRNA相對表達量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.295，P>0.05)。

2.63組HASMC中IGF-1蛋白表達水平比較結(jié)果見圖2。mimic組、mimic對照組和空白對照組HASMC中IGF-1蛋白相對表達量分別為0.602 0±0.017 3、0.040 3±0.006 2、0.051 6±0.001 0；mimic 組HASMC中IGF-1蛋白相對表達量顯著高于mimic對照組和空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=29.026、31.557，P<0.01)；mimic對照組與空白對照組HASMC中IGF-1蛋白相對表達量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.516，P>0.05)。

圖2 3組HASMC中IGF-1蛋白表達(Western blot)

3 討論

EH已經(jīng)成為嚴(yán)重危害人類健康的疾病，目前，通過生活方式干預(yù)和藥物治療，其防治已經(jīng)取得了顯著效果；然而，由于患者依從性等問題，探討EH的發(fā)病機制及診斷和治療方法仍然很重要[15]。miRNA是一類由18～25個核苷酸組成的非編碼單鏈小分子RNA，具有表達時序性、序列嚴(yán)格保守性、組織器官表達量相對特異性等特點，在細(xì)胞分化、生物發(fā)育及疾病發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮巨大作用[7，10，16]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，血液、尿液等體液中含有循環(huán)miRNA(circulating miRNA，cmiRNA)，其可以作為新的疾病標(biāo)志物。由于cmiRNA具有方便獲取、易于研究等特點，其在最近幾年逐漸成為疾病標(biāo)志物及發(fā)病機制研究的熱點[8，17-19]。miRNA-505-3p為miRNA的一種，其在腫瘤及心血管疾病中起重要作用[9]。本研究結(jié)果顯示，EH患者血漿miRNA-505-3p相對表達量顯著高于非EH患者，血漿miRNA-505-3p的ROC下面積為 0.988 1，95%可信區(qū)間為0.972 4～0.999 0；提示血漿miRNA-505-3p可以作為EH的生物標(biāo)志物。雖然，EH的診斷和治療較為簡單，但是，高血壓種類較多，血漿miRNA-505-3p檢測可能對難治性高血壓和特殊類型高血壓的診斷和治療具有重大意義。

目前，miRNA和EH關(guān)系的研究逐漸成為熱點，而且研究重點逐漸發(fā)展到miRNA對其相應(yīng)靶基因的調(diào)控水平[23-24]。本研究通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，miRNA-505-3p的靶基因可能主要為IGF-1，并調(diào)控其相關(guān)信號通路。本研究結(jié)果顯示，EH患者血漿中IGF-1水平顯著高于非EH患者，提示miRNA-505-3p與IGF-1可能存在調(diào)控關(guān)系。HASMC轉(zhuǎn)染實驗結(jié)果顯示，mimic組HASMC中miRNA-505-3p相對表達量顯著高于mimic對照組和空白對照組，mimic對照組與空白對照組HASMC中miRNA-505-3p和IGF-1 mRNA相對表達量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；提示miRNA-505-3p對IGF-1存在調(diào)控作用。

EH的病理生理過程主要涉及動脈中膜平滑肌細(xì)胞的增殖、遷移和炎癥因子分泌等[25]。本研究結(jié)果顯示，mimic組HASMC活性顯著高于mimic對照組和空白對照組，mimic對照組與空白對照組HASMC活性比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；提示miRNA-505-3p可能與EH的發(fā)病機制有關(guān)。

綜上所述，EH患者血漿中miRNA-505-3p表達上調(diào)，miRNA-505-3p可能通過調(diào)控IGF-1及其相關(guān)信號通路參與EH的發(fā)病機制，并且可以作為EH的生物標(biāo)志物。然而，由于本研究的樣本量較小，其具體機制還有待后續(xù)大樣本實驗來驗證。miRNA與EH發(fā)病機制的研究為EH的防治開啟了新方向，從而可能開辟新途徑解決此類疾病臨床診治困難問題，但是還需要相關(guān)實驗繼續(xù)證明。