韓 志，申 晟，秦曉飛，王慶豐

(河南省洛陽正骨醫(yī)院脊柱科 河南省骨科醫(yī)院，河南 洛陽 471002)

骨肉瘤是最常見的非造血性原發(fā)性惡性骨腫瘤，好發(fā)于青少年，25歲以下患者居多[1]。骨肉瘤惡性程度高，多數(shù)患者確診時(shí)已出現(xiàn)肺部轉(zhuǎn)移，預(yù)后差。單純手術(shù)治療患者的5 a生存率僅10%～20%，手術(shù)聯(lián)合術(shù)前、術(shù)后化學(xué)治療患者的5 a生存率可達(dá)到50%[2-3]，但仍有很大一部分患者由于耐藥等原因治療效果差。CD117是由人類原癌基因c-KIT編碼的一種跨膜酪氨酸激酶受體，屬于免疫球蛋白超家族成員。c-KIT基因調(diào)節(jié)多種生物反應(yīng)，包括細(xì)胞趨化性、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡和黏附。CD117在多種惡性腫瘤中異常表達(dá)，與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[4-6]。本研究通過觀察CD117在骨肉瘤組織中的表達(dá)，并分析CD117表達(dá)與骨肉瘤臨床病理特征的關(guān)系，探討CD117在骨肉瘤發(fā)生和發(fā)展中的作用，旨在為骨肉瘤的治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1一般資料2009年1月至2016年12月洛陽正骨醫(yī)院收治骨肉瘤患者45例，男27例，女18例；年齡10～64(26.1±13.2)歲；病程15 d至18個(gè)月，平均(7.2±4.3)個(gè)月；有肺部轉(zhuǎn)移灶10例，無肺部轉(zhuǎn)移灶35例；TNM分期：Ⅰ期7例，Ⅱ～Ⅲ期28例，Ⅳ期10例；低級(jí)別骨肉瘤7例(髓內(nèi)高分化骨肉瘤5例，皮質(zhì)旁骨肉瘤2例)，高級(jí)別骨肉瘤(普通型骨肉瘤)38例。所有患者經(jīng)術(shù)前穿刺病理檢查確診為骨肉瘤，且未行放射治療、化學(xué)治療及其他藥物治療，并排除并發(fā)有其他惡性腫瘤及嚴(yán)重疾病者。選取骨肉瘤組織及腫瘤周圍正常骨組織石蠟包埋標(biāo)本各45例。

1.2試劑與儀器兔抗人單克隆抗體CD117、Envision法檢測試劑盒、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)、抗原修復(fù)液、二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色液及過氧化物酶阻斷劑(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)，EC350石蠟包埋機(jī)、HM360切片機(jī)(德國Microm公司)，BX41光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.3免疫組織化學(xué)法檢測骨肉瘤組織及正常骨組織中CD117的表達(dá)取石蠟標(biāo)本，連續(xù)切片，厚度約4 μm，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水；浸入 30 g·L-1過氧化氫溶液中，37 ℃孵育10 min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；PBS沖洗3次，每次5 min；置于乙二胺四乙酸溶液中，微波加熱至98 ℃持續(xù) 15 min，冷卻后PBS沖洗3次，每次5 min；加入山羊血清，室溫下孵育10 min；滴加一抗，4 ℃過夜孵育，PBS沖洗3次，每次5 min；滴加二抗，室溫下孵育 30 min；PBS沖洗3次，每次5 min；二氨基聯(lián)苯胺染色，自來水沖洗，蘇木精復(fù)染，脫水、透明、中性樹脂封片；以PBS替代一抗作為陰性對(duì)照，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.4結(jié)果判斷CD117主要表達(dá)于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，呈淡黃色至棕褐色。結(jié)果判讀采用染色強(qiáng)度結(jié)合陽性細(xì)胞百分比進(jìn)行綜合評(píng)分。染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：無著色記0分，弱著色記1分，即陽性染色在200倍或400倍視野下可見，但在100倍或40倍視野下不能清晰可見；中度著色記2分，即陽性染色在100倍視野下清晰可見；強(qiáng)著色記3分，即陽性染色在40倍視野下清晰可見。陽性細(xì)胞百分比評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：陽性細(xì)胞≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，>50%為3分。以2項(xiàng)得分的乘積對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定：0分為不表達(dá)，1～2分為弱表達(dá)，3～6分為中度表達(dá)，7～9分為強(qiáng)表達(dá)。將不表達(dá)和弱表達(dá)定義為陰性，中度表達(dá)和強(qiáng)表達(dá)定義為陽性。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以百分率表示，差異性比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1骨肉瘤組織及正常骨組織中CD117的表達(dá)結(jié)果見圖1。骨肉瘤組織和正常骨組織中CD117陽性表達(dá)率分別為53.3%(24/45)、0.0%(0/45)，骨肉瘤組織中CD117陽性表達(dá)率顯著高于正常骨組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=32.727，P<0.05)。

A：骨肉瘤組織；B：正常骨組織。

2.2CD117表達(dá)與骨肉瘤患者臨床病理特征的關(guān)系結(jié)果見表1。骨肉瘤組織中CD117表達(dá)與患者的年齡、性別及腫瘤直徑無相關(guān)性(P>0.05)，而與腫瘤組織學(xué)類型、腫瘤轉(zhuǎn)移及TNM分期有相關(guān)性(P<0.05)。

表1 CD117表達(dá)與骨肉瘤患者臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

C-KIT基因突變是腫瘤生長和進(jìn)展的一部分，c-KIT基因表達(dá)異?？纱碳つ[瘤細(xì)胞的持續(xù)增殖和抗凋亡信號(hào)失控，有利于腫瘤的惡性增殖，并與腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)[7-8]。

研究顯示，CD117參與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，在多種腫瘤中存在異常表達(dá)，其表達(dá)對(duì)惡性黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌、腎癌患者的預(yù)后有重要的預(yù)測價(jià)值[4-6]。YANG等[9]通過研究發(fā)現(xiàn)，CD117過表達(dá)與卵巢上皮癌的進(jìn)展相關(guān)，可作為卵巢上皮癌患者預(yù)后不良的預(yù)測因子。CD117在胃腸道間質(zhì)瘤、肝癌等的發(fā)生、發(fā)展中亦發(fā)揮重要作用，且針對(duì)CD117的靶向治療取得了顯著的效果[6，10-11]。甲磺酸伊馬替尼是酪氨酸激酶受體的特異性抑制劑，可通過阻斷酪氨酸激酶受體通路，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、分化，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，目前已應(yīng)用于臨床[12-14]。

本研究結(jié)果顯示，正常骨組織中未見CD117陽性表達(dá)，骨肉瘤組織中CD117陽性表達(dá)率為53.3%，低于WEI等[15]報(bào)道的陽性表達(dá)率(62.5%)，但略高于林金鑾等[16]報(bào)道的陽性表達(dá)率(49.1%)；提示骨肉瘤組織中CD117表達(dá)上調(diào)。本研究結(jié)果顯示，骨肉瘤組織中CD117表達(dá)與腫瘤組織學(xué)類型、腫瘤轉(zhuǎn)移及TNM分期有相關(guān)性，CD117在高級(jí)別骨肉瘤組織中的陽性表達(dá)率顯著高于低級(jí)別骨肉瘤組織，TNM分期Ⅱ～Ⅲ期、Ⅳ期骨肉瘤組織中CD117陽性表達(dá)率顯著高于TNM分期Ⅰ期患者，有腫瘤轉(zhuǎn)移患者骨肉瘤組織中CD117陽性表達(dá)率顯著高于無轉(zhuǎn)移者；表明CD117參與了骨肉瘤腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等過程，CD117表達(dá)可以作為骨肉瘤惡性程度的判斷指標(biāo)。

綜上所述，CD117在骨肉瘤組織中表達(dá)上調(diào)，且與腫瘤組織分化程度、腫瘤轉(zhuǎn)移及TNM分期有相關(guān)性，CD117可以作為骨肉瘤惡性程度的判斷指標(biāo)，對(duì)深入研究酪氨酸激酶抑制劑在骨肉瘤靶向治療中的應(yīng)用有重要參考價(jià)值。