王玉君，林秀艷，王 濤

(1.海南省腫瘤醫(yī)院核醫(yī)學科，海南 ?？?570311；2.齊齊哈爾醫(yī)學院醫(yī)藥科學研究院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

甲狀腺癌是常見的內(nèi)分泌系統(tǒng)腫瘤，其發(fā)病率較高，約占惡性腫瘤的1.5%。甲狀腺癌按照組織形態(tài)學可分為乳頭狀癌、濾泡狀癌、髓樣癌和未分化癌[1-2]。甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)占甲狀腺癌的60%～80%，年齡分布較廣，且呈現(xiàn)年輕化趨勢[3-4]。PTC常出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，屬于分化型甲狀腺癌，分化程度較高[5]。PTC起病隱匿，不易被發(fā)現(xiàn)，但是，相對于未分化甲狀腺癌，PTC預(yù)后較好[6-7]。目前，PTC的治療主要包括手術(shù)切除和碘-131(131I)治療[8-9]。PTC對化學治療藥物不敏感，臨床缺乏有效的化學治療藥物[10-11]。微小RNA(microRNA，miRNA或miR)是一種存在于真核生物中的非編碼RNA，約由20～25個核苷酸組成，具有多種生物學功能[12]。研究表明，miRNA參與胃癌、骨肉瘤、肺癌、膀胱癌、胰腺癌、唾液腺樣囊癌及結(jié)腸癌等多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[13-20]。本研究旨在探討miR-582-5p在人PTC組織中的表達及其靶向調(diào)控AKT3對PTC細胞增殖和凋亡的影響，以期為PTC的診斷和治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1標本來源選取2017年1月至2017年10月海南省腫瘤醫(yī)院甲狀腺外科手術(shù)切除的PTC組織及癌旁組織(距離腫瘤邊緣1～2 cm)標本各10例，男4例，女6例，年齡20～50(29.7±7.6)歲。所有患者術(shù)前未接受放射治療和化學治療，術(shù)后經(jīng)病理學檢查確診。組織標本經(jīng)甲醛固定，石蠟包埋保存。本研究通過醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，所有患者簽署知情同意書，自愿參與本研究。

1.2細胞、試劑與儀器人PTC K1細胞(廣州吉妮歐生物科技有限公司)，高糖達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium,DMEM)、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、無血清Opti培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)，胰蛋白酶(美國Sigma公司)，青霉素-鏈霉素混合液(雙抗)、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)、四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)試劑盒、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白定量試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，末端脫氧核苷?；D(zhuǎn)移酶介導性dUTP切口末端標記(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)試劑盒(德國Roche公司)，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000(美國Santa Cruz公司)，40 g·L-1多聚甲醛(北京索萊寶科技有限公司)，TRIzol試劑、細胞培養(yǎng)箱、Nanodrop儀(美國Thermo公司)，RNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)，聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司)，細胞培養(yǎng)板(美國Corning公司)，RIPA細胞裂解液(北京百泰克生物科技有限公司)，AKT3抗體、β-actin抗體(美國Abcam公司)，miR-582-5p mimics(miR-582-5p類似物)、miR-582-5p抑制劑miR-582-5p反義miRNA寡核苷酸(anti-miRNA oligonucleotide,AMO)及陰性對照物序列引物等均由上海吉瑪生物科技有限公司設(shè)計并合成，低溫高速離心機(湖南恒諾醫(yī)用設(shè)備有限公司)，酶標儀(德國Tecan公司)，顯微鏡(日本Nikon公司)，細胞計數(shù)儀(上海睿鈺生物科技有限公司)。

1.3方法

1.3.1實時熒光定量PCR檢測PTC組織和癌旁組織中miR-582-5p表達應(yīng)用TRIzol試劑盒提取組織總RNA，并檢測總RNA純度。將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進行擴增，以磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase,GAPDH)為內(nèi)參。引物序列：miR-582-5p上游引物序列為5′-GCACACATTGAAGAGGACAGAC-3′，下游引物序列為5′-TATTGAAGGGGGTTCTGGTG-3′；GAPDH上游引物序列為5′-TCCACTGGCGTCTTCACC-3′，下游引物序列為5′-GGCAGAGATGATGACCCTTTT-3′。PCR反應(yīng)體系：10 μL SYBR Green、7 μL高壓滅菌蒸餾水、1 μL cDNA和2 μL相應(yīng)引物。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，連續(xù)進行40個循環(huán)；每個樣本重復(fù)4次，采用2-△△Ct法獲得miR-582-5p的相對表達量。

1.3.2細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組從液氮罐中取出PTC K1細胞，置于37 ℃水浴鍋中快速晃動，1 min內(nèi)融化冷存液，并轉(zhuǎn)移至37 ℃培養(yǎng)液中，輕輕吹勻；1 000 r·min-1離心10 min，棄上清液。用適量培養(yǎng)液吹勻細胞沉淀，轉(zhuǎn)移至細胞培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、含體積分數(shù)5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞，胰蛋白酶消化，接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞生長融合度達到50%～60%時分為miR-582-5p mimics組、miR-582-5p AMO組、mimics對照組和AMO對照組，采用轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體Lipofect amine 2000和無血清Opti培養(yǎng)基進行細胞轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前，棄去原培養(yǎng)液，加入無血清Opti培養(yǎng)基饑餓細胞2 h。轉(zhuǎn)染6 h后更換新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)細胞，24 h后收集4組K1細胞，進行后續(xù)實驗。

1.3.3實時熒光定量PCR法檢測4組K1細胞中miR-582-5p表達應(yīng)用TRIzol試劑盒提取細胞總RNA，并檢測總RNA純度。將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板進行擴增，以U6為內(nèi)參。引物序列：miR-582-5p上游引物序列為5′-GCACACATTGAAGAGGACAGAC-3′，下游引物序列為5′-TATTGAAGGGGGTTCTGGTG-3′；U6上游引物序列為5′-GCTTCGGCAGCACATATACT-3′，下游引物序列為5′-TTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。PCR反應(yīng)體系：10 μL SYBR Green、7 μL高壓滅菌蒸餾水、1 μL cDNA和 2 μL 相應(yīng)引物。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，連續(xù)進行40個循環(huán)；每個樣本重復(fù)4次，采用2-△△Ct法獲得miR-582-5p的相對表達量。

1.3.4MTT法檢測4組K1細胞活性取各組轉(zhuǎn)染后細胞，胰蛋白酶消化，接種于96孔板，調(diào)整細胞密度為每孔4×104個，每組設(shè)置6個復(fù)孔，分別于培養(yǎng)0、12、24、36、48 h后棄去培養(yǎng)液，每孔加入500 μL 0.5 g·L-1MTT溶液，37 ℃孵育4 h，每孔加入100 μL二甲基亞砜，避光條件下?lián)u床輕輕搖晃1 min，繼續(xù)孵育10 min，應(yīng)用酶標儀于波長490 nm處測定各孔吸光度。

1.3.5平板克隆形成實驗檢測4組K1細胞克隆能力取各組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24 h的細胞，胰蛋白酶消化，接種于35 mm小皿中，每皿300個細胞，每組設(shè)置3個復(fù)皿，每3 d更換新鮮培養(yǎng)液，培養(yǎng)10 d后PBS清洗細胞3次，40 g·L-1多聚甲醛固定，1 g·L-1結(jié)晶紫溶液染色；以≥50個細胞作為1個克隆，計數(shù)各組細胞克隆數(shù)量。

1.3.6錐蟲藍染色檢測4組K1細胞存活率取各組轉(zhuǎn)染后細胞，接種于6孔板，24 h后用胰蛋白酶消化細胞，1 000 r·min-1離心10 min，棄上清液。向細胞沉淀中加入錐蟲藍染色液。應(yīng)用細胞計數(shù)板在細胞計數(shù)儀上觀察細胞，藍染代表死亡細胞，計算細胞存活率。每組細胞重復(fù)3次，取均值。

1.3.7TUNEL法檢測4組K1細胞凋亡情況取各組轉(zhuǎn)染后細胞，接種于小皿中，接種密度為4×104cm-2，24 h后棄去小皿中的培養(yǎng)液，PBS洗滌，40 g·L-1多聚甲醛固定，山羊血清孵育1 h進行封閉，并用體積分數(shù)0.5%Triton溶液進行穿透，按照試劑盒說明書將Vial1和Vial2按照19的比例混合，用混合物避光孵育細胞1 h。PBS洗凈后使用Hoechst染色液孵育細胞，并于倒置熒光顯微鏡下觀察染色情況，拍照并計算細胞凋亡率。

1.3.8miR-582-5p靶基因預(yù)測利用TargetScan Human7.2在線軟件(http://www.targetscan.org/vert_72/)預(yù)測人miR-582-5p的靶基因。從miR-582-5p的靶點基因中發(fā)現(xiàn)AKT3與人類多種腫瘤相關(guān)，如乳腺癌、胃癌、卵巢癌、甲狀腺癌、黑色素瘤、前列腺癌和結(jié)腸癌等。因此，推測miR-582-5p可能通過靶向調(diào)控AKT3的表達而發(fā)揮抑制PTC細胞增殖及促進其凋亡的作用。

1.3.9Westernblot法檢測4組K1細胞中AKT3蛋白表達取各組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24 h的細胞，接種于6孔板，提取細胞中總蛋白，超聲震碎并裂解蛋白，應(yīng)用BCA試劑盒檢測總蛋白濃度，加入蛋白樣品、蛋白上樣緩沖液和蒸餾水，混勻，在金屬浴中煮沸，使蛋白質(zhì)變性。將蛋白樣本和Marker進行凝膠電泳分離，電泳結(jié)束后進行轉(zhuǎn)膜、封閉和洗膜，加入AKT3抗體一抗(11 000稀釋)，4 ℃過夜孵育，PBS洗滌3次，每次5 min，加入二抗(11 000稀釋)，并進行掃膜。以β-actin為內(nèi)參，檢測AKT3蛋白相對表達量。

2 結(jié)果

2.1PTC組織和癌旁組織中miR-582-5p表達比較PTC組織和癌旁組織中miR-582-5p相對表達量分別為0.372±0.237、1.010±0.083，PTC組織中miR-582-5p相對表達量顯著低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義(t=5.003，P<0.05)。

2.24組K1細胞中miR-582-5p表達比較miR-582-5p mimics組、mimics對照組、AMO對照組和miR-582-5p AMO組K1細胞中miR-582-5p相對表達量分別為14.143±2.318、1.063±0.214、1.041±0.372、0.435±0.145；miR-582-5p mimics組細胞K1中miR-582-5p相對表達量顯著高于mimics對照組、miR-582-5p AMO組和AMO對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(t=4.834、4.975、7.163，P<0.05)。miR-582-5p AMO組K1中miR-582-5p相對表達量顯著低于AMO對照組和mimics對照組，差異有統(tǒng)計學意義(t=5.916、5.619，P<0.05)；mimics對照組與AMO對照組K1中miR-582-5p相對表達量比較差異無統(tǒng)計學意義(t==30.715，P>0.05)。

2.34組K1細胞活性比較結(jié)果見表1和圖1。細胞培養(yǎng)0 h時4組K1細胞活性比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。細胞培養(yǎng)12、24、36、48 h時，miR-582-5p mimics組K1細胞活性顯著低于miR-582-5p AMO組、mimics對照組和AMO對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；miR-582-5p AMO組K1細胞活性顯著高于mimics對照組和AMO對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；mimics對照組與AMO對照組K1細胞活性比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表1 4組K1細胞活性比較

注：與miR-582-5p AMO組、mimics對照組和AMO對照組比較aP<0.05；與mimics對照組和AMO對照組比較bP<0.05。

圖1 4組K1細胞活性比較

2.44組K1細胞克隆形成能力比較mimics對照組、miR-582-5p mimics組、AMO對照組、miR-582-5p AMO組K1細胞克隆數(shù)量分別為18.47±5.25、5.10±4.97、19.53±6.45、32.63±7.74；miR-582-5p mimics組K1細胞克隆數(shù)量顯著少于mimics對照組、AMO對照組和miR-582-5p AMO組，差異有統(tǒng)計學意義(t=2.531、5.734、6.623，P<0.05)；miR-582-5p AMO組K1細胞克隆數(shù)量顯著多于AMO對照組和mimics對照組，差異有統(tǒng)計學意義(t=3.193、5.853，P<0.05)；mimics對照組與AMO對照組K1細胞克隆數(shù)量比較差異無統(tǒng)計學意義(t=32.851，P>0.05)。

2.54組K1細胞存活率比較mimics對照組、miR-582-5p mimics組、AMO對照組和miR-582-5p AMO組K1細胞存活率分別為(76.46±13.53)%、(42.64±10.85)%、(77.82±10.35)%、(83.63±13.53)%；miR-582-5p mimics組K1細胞存活率顯著低于mimics對照組、AMO對照組和miR-582-5p AMO組，差異有統(tǒng)計學意義(t=3.881、6.634、21.810，P<0.05)；miR-582-5p AMO組K1細胞存活率顯著高于AMO對照組和mimics對照組，差異有統(tǒng)計學意義(t=2.482、11.871，P<0.05)；mimics對照組與AMO對照組K1細胞存活率比較差異無統(tǒng)計學意義(t=31.640，P>0.05)。

2.64組K1細胞凋亡率比較結(jié)果見圖2。mimics對照組、miR-582-5p mimics組、AMO對照組和miR-582-5p AMO組K1細胞凋亡率分別為(23.35±9.64)%、(42.63±13.38)%、(22.85±9.74)%、(10.84±3.64)%；miR-582-5p mimics組K1細胞凋亡率顯著高于mimics對照組、AMO對照組和miR-582-5p AMO組，差異有統(tǒng)計學意義(t=5.956，15.753、15.756，P<0.05)；miR-582-5p AMO組細胞凋亡率顯著低于AMO對照組和mimics對照組，差異有統(tǒng)計學意義(t=6.840、7.862，P<0.05)；mimics對照組與AMO對照組K1細胞凋亡率比較差異無統(tǒng)計學意義(t=41.850，P>0.05)。

圖2 4組K1細胞凋亡情況

2.74組K1細胞中AKT3蛋白表達比較結(jié)果見圖3。mimics對照組、miR-582-5p mimics組、AMO對照組和miR-582-5p AMO組K1細胞中AKT3蛋白相對表達量分別為1.000±0.005、0.531±0.162、1.010±0.071、1.432±0.141；miR-582-5p mimics組K1細胞中AKT3蛋白相對表達量顯著低于mimics對照組、AMO對照組和miR-582-5p AMO組，差異有統(tǒng)計學意義(t=8.933、22.34、15.110，P<0.05)；miR-582-5p AMO組K1細胞AKT3蛋白相對表達量顯著高于AMO對照組和mimics對照組，差異有統(tǒng)計學意義(t=9.240、19.673，P<0.05)；mimics對照組與AMO對照組K1細胞AKT3蛋白相對表達量比較差異無統(tǒng)計學意義(t=31.450，P>0.05)。

圖3 4組K1細胞中AKT3蛋白表達(Western blot)

3 討論

miRNA是一類高度保守的內(nèi)源性非編碼RNA，長度約22個核苷酸，廣泛存在于病毒和高等生物，其能夠通過堿基互補原理與靶基因的mRNA結(jié)合，降解靶基因的mRNA或抑制其翻譯，在細胞的存活、分化、增殖和凋亡等過程中起著重要作用，并參與腫瘤等多種疾病的發(fā)生和發(fā)展[21-22]。本研究的目的是探究miR-582-5p在甲狀腺癌組織和細胞中的表達以及miR-582-5p對甲狀腺癌細胞增殖和凋亡的作用，并分析其具體機制。本研究結(jié)果顯示，miR-582-5p在甲狀腺癌組織和細胞中表達顯著下調(diào)；提示miR-582-5p可能參與甲狀腺癌的發(fā)生和發(fā)展過程，且在甲狀腺癌中是抑癌基因。但是，本研究樣本量較小，尚不足以證明miR-582-5p可以作為甲狀腺癌的生物標志物，有待增加樣本量進一步證實，為甲狀腺癌的診斷和治療提供新的、重要的生物標志物，為甲狀腺癌的治療提供實驗基礎(chǔ)和新思路。

AKT3基因是一種與細胞周期G2期有關(guān)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，能夠維持細胞周期，且抑制細胞發(fā)生凋亡，從而參與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[23-24]。本研究結(jié)果顯示，miR-582-5p能夠降低人PTC K1細胞的活性，抑制人PTC K1細胞增殖，促進人PTC K1細胞凋亡，其機制可能與miR-582-5p調(diào)控AKT3基因表達有關(guān)。近幾年來，miRNA在不同腫瘤中的作用和角色的研究已經(jīng)成為熱點。MiRNA 在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移和耐藥等過程中起著十分重要的調(diào)控作用，其通過靶向作用多種癌基因或抑癌基因，在腫瘤細胞分化、血管生成、上皮間葉細胞分化、轉(zhuǎn)移及耐藥性等方面起一定的作用。miRNA丟失或功能調(diào)節(jié)異常均有可能導致腫瘤的發(fā)生。miRNA的作用主要通過2種方式實現(xiàn)：miRNA減少和miRNA替代。miRNA減少適用于在腫瘤組織中表達上調(diào)的miRNA，而miRNA適用于在腫瘤組織中表達下調(diào)或缺失的miRNA。此外，研究顯示，miRNA參與了甲狀腺癌的發(fā)生和發(fā)展過程，miR-144-3p能夠通過靶向調(diào)控其靶基因ROCK1的表達，進而抑制PTC細胞增殖、遷移和侵襲，為臨床治療甲狀腺癌提供新的靶點[23]。miR-125a-5p能夠通過抑制其靶基因CD147的表達而調(diào)控甲狀腺癌細胞糖代謝和腫瘤細胞的惡性程度，在甲狀腺癌中發(fā)揮抑癌基因的作用，這為甲狀腺癌的治療提供了新的方法和靶點[24]。本研究觀察了miR-582-5p對人PTC K1細胞增殖和凋亡的影響，而未探究其對人PTC K1細胞遷移和侵襲的影響，在后續(xù)的研究中將會繼續(xù)探究miR-582-5p對人PTC K1細胞遷移和侵襲等其他生物學特征的影響。

綜上所述，人PTC組織和細胞中miR-582-5p表達顯著下調(diào)，miR-582-5p可能通過靶向作用于AKT3而抑制PTC細胞的增殖，促進其發(fā)生凋亡，該研究為研究PTC的發(fā)病機制及臨床治療提供新的方法和思路。