陳 默，蘇振中，張 群，辛 桐，高 鵬

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,吉林 長春130000)

半乳糖凝集素-3(Gal-3)是凝集素家族的重要成員，主要分布于腫瘤細(xì)胞、上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及炎性細(xì)胞，可參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長，抗凋亡和介導(dǎo)細(xì)胞粘附等多種生物學(xué)功能[1]。在不同條件下，其生物學(xué)功能可表現(xiàn)為促炎和抗炎兩種作用。在細(xì)胞內(nèi)，其可充當(dāng)炎癥信號分子，參與固有免疫介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。分泌到胞外的Gal-3可與LPS(脂多糖)直接結(jié)合，減少LPS刺激后促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而發(fā)揮其抗炎效應(yīng)[2]。Gal-3在腫瘤、心血管疾病、風(fēng)濕系統(tǒng)疾病、腎臟疾病中呈高表達(dá)，近年來研究發(fā)現(xiàn)，Gal-3參與COPD等呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生機(jī)制，本研究通過對COPD患者和健康受試者痰上清液中Gal-3水平的測定，旨在明確痰中Gal-3在COPD不同炎癥亞型中的表達(dá)及作用。

1 材料與方法

1.1一般資料隨機(jī)納入在我院呼吸內(nèi)科就診的COPD穩(wěn)定期患者80例，同期招募26例健康受試者為對照組。所有COPD患者均符合2017年GOLD指南制定的COPD診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]，具體納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)肺功能檢查：吸入支氣管舒張劑后，第一秒用力呼氣容積(FEV1)/用力肺活量(FVC)<0.7,且FEV1占預(yù)計(jì)值的百分比<80%。(2)COPD患者處于穩(wěn)定期，即咳嗽、咳痰、呼吸困難等癥狀近期無加重。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有缺血性心臟病、充血性心力衰竭、腎衰竭、腫瘤、肺間質(zhì)纖維化、哮喘和活動性結(jié)核的患者。收集并記錄患者一般資料、臨床信息、病史等，同時(shí)進(jìn)行體格檢查、肺功能檢查以及誘導(dǎo)痰檢測。根據(jù)誘導(dǎo)痰炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)將COPD患者分為2種亞型，即：嗜酸性粒細(xì)胞型COPD(痰液嗜酸性粒細(xì)胞超過2.5%)和非嗜酸性粒細(xì)胞型COPD(痰液嗜酸性粒細(xì)胞少于2.5%)。本研究已由吉林大學(xué)第二醫(yī)院倫理委員會通過，所有參加者均已簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1肺功能檢查 所有參加者都進(jìn)行肺功能檢查，具體按照ATS2014年發(fā)表的肺功能指南進(jìn)行[4]。

1.2.2誘導(dǎo)痰細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類 我們對所有參與者均使用4.5%的濃氯化鈉進(jìn)行痰誘導(dǎo)15 min，從痰液中分離痰栓后，使用4倍體積的二硫蘇糖醇(DTT)分散細(xì)胞，37℃旋轉(zhuǎn)混合30 min，并將細(xì)胞重懸于磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中，過濾懸浮液并進(jìn)行總細(xì)胞計(jì)數(shù)并應(yīng)用臺盼蘭染色進(jìn)行細(xì)胞活力測定。同時(shí)將懸浮液離心，留取痰上清液，進(jìn)行細(xì)胞涂片，然后甲醇、蘇木精伊紅(HE)、鉻變酸2R染色后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。根據(jù)高倍視野下嗜酸性粒細(xì)胞所占比例分為嗜酸性粒細(xì)胞型COPD和非嗜酸性粒細(xì)胞型COPD，具體誘導(dǎo)痰的采集方法與標(biāo)本處理均按推薦步驟進(jìn)行[5]。

1.2.3半乳糖凝集素3濃度測定 痰上清Gal-3水平使用定量的酶聯(lián)免疫吸附試劑盒測定(R&D Systems，Minneapolis，MN，USA)，詳細(xì)步驟按試劑盒說明書操作。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 20統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，定量資料先行正態(tài)性檢驗(yàn),呈正態(tài)分布的變量用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，呈非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用中位數(shù)表示，定性資料采用t檢驗(yàn)。多組資料比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1基線資料分析本研究共收集COPD試驗(yàn)組80例，男37例，女43例，健康對照組26例，男10例，女16例。比較兩組性別、BMI值均無明顯差異(P值分別為0.579，0.07)，而COPD組年齡和吸煙指數(shù)明顯高于對照組(P<0,001,P=0.002)，且83%的COPD患者應(yīng)用糖皮質(zhì)激素。誘導(dǎo)痰細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示：與健康對照組相比，COPD組痰中的炎癥細(xì)胞總數(shù)明顯升高(P=0.029)，且以中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞升高為主，差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。接下來對兩組痰中的Gal-3和炎性因子IL-6結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：兩組相比，Gal-3的表達(dá)無明顯差異(P=0.862)，而COPD組中IL-6的表達(dá)水平則明顯高于健康對照組(P=0.012)(表1)。根據(jù)炎癥亞型分類標(biāo)準(zhǔn)和誘導(dǎo)痰的檢測結(jié)果對COPD組進(jìn)行分類：嗜酸性粒細(xì)胞型COPD患者24例，非嗜酸性粒細(xì)胞型COPD患者56例。然后對嗜酸性粒細(xì)胞型COPD和非嗜酸性粒細(xì)胞型COPD患者的年齡、性別、BMI、肺功能檢查、糖皮質(zhì)激素應(yīng)用、痰中炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)行比較，均無明顯差異(P>0.05)(表2)。

表1 兩組患者臨床特征比較

注：*非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用中位數(shù)(四分位間距)表示。GAL-3數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化用ANCOVA校正(年齡、BMI、吸煙)。

表2 不同COPD炎癥亞型患者臨床特征比較

注：*非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用中位數(shù)(四分位間距)表示。

2.2COPD組中Gal-3和炎性因子分析我們對COPD組中嗜酸性粒細(xì)胞亞型和非嗜酸粒細(xì)胞亞型中的炎性因子進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：與非嗜酸性粒細(xì)胞性COPD(Gal-3=285.1)相比，嗜酸粒細(xì)胞性COPD(Gal-3=467.7)痰中的Gal-3表達(dá)較明顯升高，其水平相差近2倍，差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而其他炎性因子檢測結(jié)果顯示，嗜酸性粒細(xì)胞型COPD的IL-6、CRP和SAA表達(dá)明顯低于非嗜酸性粒細(xì)胞型COPD(P<0.05)(圖1)。相關(guān)性分析顯示：COPD患者痰中Gal-3表達(dá)與嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)呈明顯正相關(guān)，而與中性粒細(xì)胞呈明顯負(fù)相關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2)。

圖1 嗜酸性粒細(xì)胞型COPD和非嗜酸性粒細(xì)胞型COPD患者各炎性介質(zhì)水平比較

圖2 COPD患者Gal-3水平與各炎癥細(xì)胞之間的關(guān)系

3 討論

COPD是一種氣流受限不完全可逆、呈進(jìn)行性發(fā)展，與氣道和肺部對有害顆?；蛴泻怏w的慢性炎癥反應(yīng)增強(qiáng)有關(guān)的疾病，并導(dǎo)致患者FEV1逐年下降速度明顯高于正常人。最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，中國COPD的總發(fā)病率為8.6%，而40歲以上人群中COPD的患病率則高達(dá)13.7%[6]。據(jù)WHO預(yù)計(jì)，到2030年COPD將成為全球致死病因第3位，成為我國一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問題[7]。在COPD的發(fā)生機(jī)制中，炎癥因素在COPD的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用，以中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等慢性炎癥細(xì)胞浸潤為主要特征。這些細(xì)胞分泌的炎癥介質(zhì)和酶，可誘導(dǎo)氣道炎癥和結(jié)構(gòu)的變化。我們課題組的前期工作利用誘導(dǎo)痰炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)分類技術(shù)，從病理生理學(xué)角度將COPD分為如下四個(gè)亞型，即：嗜酸性粒細(xì)胞型、中性粒細(xì)胞型、混合性粒細(xì)胞型和粒細(xì)胞缺乏型[8]，由于各個(gè)亞型的病理生理表現(xiàn)以及對藥物治療反應(yīng)存在明顯差異，因此臨床上區(qū)分COPD炎癥亞型對指導(dǎo)治療至關(guān)重要。

Gal-3是嵌合型半乳糖凝集素的獨(dú)特成員，廣泛分布并定位于細(xì)胞外，細(xì)胞質(zhì)和核區(qū)域。其與細(xì)胞表面的β-半乳糖苷結(jié)合而顯示細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)功能[9]。Gal-3在細(xì)胞外起著活化炎癥細(xì)胞的作用。Gal-3可通過其凝集素功能激活巨噬細(xì)胞發(fā)揮吞噬作用，并可促進(jìn)IL-1β，IL-6、TNF-α等炎癥因子的表達(dá)，在炎癥早期發(fā)揮促炎作用。在炎癥后期抑制炎癥過度反應(yīng)而促進(jìn)組織修復(fù)。且有研究表明，外源性Gal-3可提高巨噬細(xì)胞吞噬凋亡上皮細(xì)胞的能力[10]。巨噬細(xì)胞活性增加，可能更有效地清除氣道中的病原體和凋亡細(xì)胞，其中包括中性粒細(xì)胞。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了Gal-3抑制了中性粒細(xì)胞的滲出，同時(shí)增加凋亡中性粒細(xì)胞的消除[11,12]。

在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，非嗜酸性粒細(xì)胞型COPD中Gal-3表達(dá)明顯下降，且Gal-3表達(dá)水平與中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)呈負(fù)相關(guān)，一方面提示中性粒細(xì)胞在肺內(nèi)滲出減少，另一方面巨噬細(xì)胞吞噬功能下降，尤其吞噬凋亡中性粒功能下降，導(dǎo)致中性粒炎癥介質(zhì)釋放，增加氣道炎癥水平。同時(shí)，在非嗜酸性粒細(xì)胞型COPD中，IL6、CRP、SAA水平明顯增高，提示在此亞型中氣道炎癥水平明顯高于嗜酸性粒細(xì)胞型COPD。

另有研究證實(shí)，Gal-3在炎癥性腸病患者腸上皮細(xì)胞中的表達(dá)顯著下降[13]，Gil CD的研究也發(fā)現(xiàn)在大鼠腹膜炎模型中，炎癥早期Gal-3表達(dá)明顯降低[14]，Gal-3敲除的大鼠肺組織顯示彌漫性炎癥，這與我們的研究結(jié)果一致，提示Gal-3在炎癥性疾病中可能表現(xiàn)為抗炎作用，這也為炎癥性疾病提供了一種新的潛在的治療靶點(diǎn)[15]。

本研究結(jié)果提示Gal-3參與了COPD患者 的炎癥亞型發(fā)病機(jī)制，調(diào)節(jié)了氣道炎癥細(xì)胞分布，降低了氣道炎癥水平，起到了抗炎作用。因此，Gal-3可能成為臨床鑒別COPD炎癥亞型的新介質(zhì)，并可能成為COPD個(gè)體化治療的新靶點(diǎn)。