高世華，池細(xì)俤，李國(guó)玉，吳文輝

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬南平第一醫(yī)院 檢驗(yàn)科，福建 南平353000)

馬爾尼菲青霉菌(penicilliummarneffei,PM)系侵襲性深部雙相真菌，多見(jiàn)于AIDS患者，或長(zhǎng)期應(yīng)用免疫抑制劑的患者，但近年來(lái)臨床上非AIDS患者患馬爾尼菲青霉菌病(Penicilliosismarneffei,PSM)也逐年增加。現(xiàn)將某院2015年至2017年間收治的PSM病例資料及PM實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)情況進(jìn)行總結(jié)分析。

1 材料與方法

1.1病例資料2015.01-2017.11某院共收治PM感染13例；其中：男12例、女1例；年齡34-79歲； PM菌株來(lái)源：分離自患者的痰標(biāo)本10株、鼻咽部拭子1株、血液標(biāo)本6株、創(chuàng)口分泌物1株(其中1患者在血液、創(chuàng)口分泌物同時(shí)分離出PM，1患者在血液、鼻咽拭子同時(shí)分離出、3患者在血液、痰標(biāo)本同時(shí)分離出)。PM檢出的月份：一月1例、三月1例、四月2例、六月2例、八月3例、九月1例、十一月3例。

1.2儀器與試劑

1.2.1主要試劑 濟(jì)南貝瑞特科技有限公司的血平板、沙保弱培養(yǎng)基；珠海貝索生物技術(shù)有限公司的棉藍(lán)染色液；法國(guó)生物-梅里埃的血培養(yǎng)瓶；ThermoFisher真菌藥敏板。

1.2.2主要儀器 法國(guó)生物-梅里埃的Bact/Alert120血培養(yǎng)儀；天津泰斯特儀器有限公司的隔水培養(yǎng)箱、MJX-70BX霉菌培養(yǎng)箱。

1.2.3質(zhì)控菌株 ATCC6258、ATCC22019。

1.3方法

1.3.1菌種鑒定 血培養(yǎng)應(yīng)用Bact/Alert120血培養(yǎng)儀進(jìn)行，陽(yáng)性指示后移種沙保弱培養(yǎng)基；痰標(biāo)本直接接種沙保弱培養(yǎng)基，分別放置37℃及25℃培養(yǎng)，逐天連續(xù)觀察，菌種鑒定參照《醫(yī)學(xué)真菌學(xué)-實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)指南》[1]。

1.3.2藥敏試驗(yàn)取培養(yǎng)48 h的37℃培養(yǎng)的酵母相菌落，配成0.5McFarland濃度的菌液，將100 μl菌液加入11 mlYeastOne肉湯，使終濃度為(0.5-5)×104cfu/ml，藥敏試驗(yàn)操作按照《ThermoFisher真菌藥敏板說(shuō)明書(shū)》，同時(shí)取10 μlYeastOne肉湯菌液接種沙保弱培養(yǎng)基進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，37℃培養(yǎng)48-60 h觀察結(jié)果，記錄無(wú)紅色或紫色出現(xiàn)的微孔中藥物濃度最低者為MIC值。如ATCC6258、ATCC22019質(zhì)控結(jié)果符合要求，并且菌落計(jì)數(shù)結(jié)果為(50-500)個(gè)/平皿，則接受本次藥敏結(jié)果，如質(zhì)控結(jié)果不符合要求或每平皿菌落小于50或大于500個(gè)則重新試驗(yàn)。

1.3.3生物安全 為防止實(shí)驗(yàn)人員吸入含PM的氣溶膠而感染，所有菌種鑒定及藥敏試驗(yàn)均須在B-2生物安全柜內(nèi)操作。

1.3.4數(shù)據(jù)分析藥敏試驗(yàn)的數(shù)據(jù)采用WHONET 5.6軟件分析。

2 結(jié)果

2.1病例資料分析

13例PM感染患者：AIDS患者5例，急性毒蕈中毒1例，慢性支氣管炎急性加重期2例，擴(kuò)張性心肌病1例，支氣管擴(kuò)張并咯血1例，慢阻肺、2型糖尿病1例，腎移植術(shù)后1例、肺結(jié)核1例。血液檢查結(jié)果： WBC(2.24-28.54×109/L)、HB(55-138 g/L)、PLT(29-375×109/L)，ALB(20-36.63 g/L)，CRP(均值49.83 mg/L)，SAA(均值119.19 mg/L)；7例患者AST>1×ULN，6例ALT>1×ULN；AST>1×ULN且AST/ALT>1者共6例。患者轉(zhuǎn)歸情況：PM感染確診后，臨床采用5-氟胞嘧啶加伊曲康唑聯(lián)合治療，除3例患者住院期間死亡外其他均癥狀好轉(zhuǎn)，死亡病例中：1例毒蕈中毒后多臟器衰竭死亡，1例非正常死亡， 1例考慮與PM感染致病情加重有關(guān)。

2.2病原學(xué)檢測(cè)

其中1例患者骨髓涂片見(jiàn)“臘腸”狀的PM菌體；PM在沙保弱培養(yǎng)基經(jīng)25℃培養(yǎng)24 h后出現(xiàn)直徑約0.5-3 mm的霉菌相菌落，并菌落周?chē)_(kāi)始出現(xiàn)鮮紅色；用透明膠取霉菌相菌落表面貼載玻片上，加棉藍(lán)染色液顯微鏡下觀察可見(jiàn)分隔菌絲和帚狀分生孢子。37℃培養(yǎng)36 h后可見(jiàn)直徑約0.5-2 mm酵母相菌落，并從菌落中央開(kāi)始出現(xiàn)棕紅色。

2.3藥敏試驗(yàn)

9種抗真菌藥物對(duì)PM的藥敏試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1，其中5-氟胞嘧啶、伏立康唑、伊曲康唑、泊沙康唑、兩性霉素B的MIC50和MIC90較低。

表1 PM的抗真菌藥物的MIC50和MIC90結(jié)果

3 討論

人主要是通過(guò)呼吸道吸入PM孢子而感染，并在機(jī)體免疫力低下時(shí)或獲得性免疫缺陷時(shí)發(fā)病。臨床上PM感染多見(jiàn)于AIDS患者，但嚴(yán)重疾病的終末期、免疫功能低下及多臟器衰竭的患者也易感染PM[2,3]，本研究病例中非AIDS患者達(dá)8/13。提示加強(qiáng)AIDS、嚴(yán)重疾病的終末期、免疫功能低下及多臟器衰竭等患者的管理對(duì)降低PSM發(fā)病率有重要意義。

PM感染人后主要寄生于巨噬細(xì)胞內(nèi)，人體需通過(guò)細(xì)胞免疫進(jìn)行清除，尤其CD4+細(xì)胞對(duì)于清除PM具有重要作用。CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量減少是AIDS患者易繼發(fā)感染PM的主要因素[4]，且PM可通過(guò)刺激AIDS患者體內(nèi)的HIV-1病毒播散特異性攻擊CD4+T淋巴細(xì)胞，使患者免疫力持續(xù)降低，從而易發(fā)生播散性PM感染[2]。病例資料顯示AIDS患者感染PM可導(dǎo)致更嚴(yán)重的后果，5例AIDS患者均出現(xiàn)了真菌血癥，臨床癥狀加重明顯。

本研究中PM感染病例發(fā)病時(shí)間分布上無(wú)季節(jié)性特征，福建省的雨季主要在春季的3-4月,夏季的6月，故本組患者發(fā)病時(shí)間也無(wú)明顯的旱雨季特征,與陳杏春等研究不一致[5]考慮與福建省地處中國(guó)東南沿海全年氣候均較潮濕悶熱適合PM生長(zhǎng)有關(guān)[6,7]。隨著臨床PSM病例的逐年增加，存在PM污染醫(yī)院環(huán)境造成醫(yī)院內(nèi)感染的可能，本研究所有患者均是入院后在住院期間感染發(fā)病，部分患者可疑符合院內(nèi)感染診斷標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)引起院感管理部門(mén)的關(guān)注。

PM患者的血常規(guī)檢驗(yàn)項(xiàng)目如WBC、HB、PLT及血清ALB未發(fā)現(xiàn)特異性變化；AIDS患者WBC較低與其HIV感染有關(guān)。但所有患者的CRP、SAA均顯著增高，均值達(dá)49.83 mg/l、119.19 mg/l，提示這兩個(gè)項(xiàng)目可以做為PM感染標(biāo)志物用于PSM病程或抗真菌療效觀察。部分PSM患者肝臟可發(fā)生實(shí)質(zhì)彌漫溶解性壞死、或肝細(xì)胞發(fā)生脂肪變性、肉芽腫樣變、化膿性及無(wú)反應(yīng)性壞死性炎癥等病理改變[8]，本組患者中AST>1×ULN且AST/ALT>1者共6例(6/7)；與胡家光等報(bào)道相符[9]，即AST>1×ULN且AST/ALT>1可以做為PSM患者肝臟病理變化的輔助指標(biāo)。

部分PSM患者可無(wú)典型臨床癥狀或者癥狀輕而易被其基礎(chǔ)病掩蓋，且PSM患者肺部癥狀與肺結(jié)核相似，臨床上易發(fā)生漏診、誤診。因此對(duì)可疑患者應(yīng)及時(shí)通過(guò)采集痰、血液等標(biāo)本進(jìn)行真菌培養(yǎng)。目前對(duì)PSM的實(shí)驗(yàn)室診斷主要依賴傳統(tǒng)的真菌培養(yǎng)和組織病理學(xué)檢查，但偶爾也可在PSM患者的血液涂片或骨髓涂片檢測(cè)出典型的PM菌體[10]，因此加強(qiáng)血液檢驗(yàn)人員對(duì)PM鏡下形態(tài)的識(shí)別能力的培訓(xùn)具有一定的臨床意義。痰標(biāo)本接種沙保弱培養(yǎng)基置25℃培養(yǎng)，初培養(yǎng)平均72 h才出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)菌落，為了提高陽(yáng)性率微生實(shí)驗(yàn)室對(duì)疑似PSM患者的真菌培養(yǎng)需連續(xù)觀察1周以上。

國(guó)內(nèi)外學(xué)者針對(duì)PM等雙相真菌的藥敏試驗(yàn)大多選用酵母相進(jìn)行試驗(yàn)[11]，但目前PM在內(nèi)的雙相真菌的藥敏試驗(yàn)的菌液濃度、孵育溫度與時(shí)間、判讀折點(diǎn)等無(wú)權(quán)威的標(biāo)準(zhǔn)。本研究也發(fā)現(xiàn)藥敏試驗(yàn)中PM的菌液濃度不易標(biāo)準(zhǔn)化是導(dǎo)致結(jié)果重復(fù)性差的重要原因之一，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)不但PM菌落的生長(zhǎng)情況及菌絲發(fā)育情況差異性很大，而且不同菌落制備的相同McFarland濁度的PM菌液的菌落計(jì)數(shù)結(jié)果可顯著差異，因此PM藥敏試驗(yàn)中菌液除了要進(jìn)行McFarland比濁儀測(cè)定濃度外，還要同時(shí)進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，只有菌落計(jì)數(shù)符合要求才接受本次藥敏結(jié)果，如不符合則需重新試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)高度關(guān)注。

由于目前CLSI無(wú)針對(duì)PM的藥敏折點(diǎn)，所以藥敏結(jié)果僅向臨床報(bào)告PM的MIC值，和本單位PM的MIC50和MIC90統(tǒng)計(jì)結(jié)果，做為臨床醫(yī)師選藥參考。臨床上PSM的抗真菌冶療方案主要是：5-氟胞嘧啶和伊曲康唑聯(lián)合治療[12]，本研究藥敏結(jié)果顯示PM對(duì)5-氟胞嘧啶、伏立康唑、伊曲康唑、泊沙康唑、兩性霉素B的MIC50和MIC90均較低，提示上述藥物對(duì)PM的敏感性較好。