国产日韩欧美一区二区三区三州_亚洲少妇熟女av_久久久久亚洲av国产精品_波多野结衣网站一区二区_亚洲欧美色片在线91_国产亚洲精品精品国产优播av_日本一区二区三区波多野结衣 _久久国产av不卡

?

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞上清液對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

2018-11-28 01:39汪文穎郝利銘黃可欣姜文華
關(guān)鍵詞:貼壁星狀胞外基質(zhì)

汪文穎,郝利銘,尹 菲,黃可欣,姜文華

(吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 組胚教研室,吉林 長(zhǎng)春130021)

隨著國(guó)內(nèi)外對(duì)干細(xì)胞研究的深入和技術(shù)的發(fā)展,間充質(zhì)干細(xì)胞(mensenchymal stem cells,MSCs)因其來(lái)源豐富,取材方便、容易,免疫原性低,具有多向分化的潛能成為治療肝纖維化的研究熱點(diǎn)[1,2]。肝纖維化是慢性肝損傷的終末期,肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells,HSCs)激活后分泌大量膠原蛋白,造成細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度沉積而導(dǎo)致的肝損傷在肝纖維化的發(fā)展過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。據(jù)相關(guān)研究[3,4]MSCs上清液含有干細(xì)胞分泌的相關(guān)因子[5],可以作為MSCs移植[6-8]的替代療法。本文利用臍帶來(lái)源的MSCs研究其上清液對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞(HSC-T6)的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞、試劑的來(lái)源

1.2 方法

1.2.1人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞( human umbilical cord mensenchymal stem cells,hUCMSCs)的純化、擴(kuò)增、凍存和復(fù)蘇

臍帶來(lái)源于吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院健康足月分娩的新生兒。本研究通過(guò)吉林大學(xué)倫理委員會(huì)審批,家屬均簽署知情同意書(shū)。按文獻(xiàn)報(bào)道的方法[9]采用組織塊貼壁法獲得hUCMSCs,采用10%FBS+DMEM+雙抗培養(yǎng)液在37℃,5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng),0.25% 胰酶消化傳代培養(yǎng)以純化。凍存:消化細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液, 1 000 rpm×3 min中 離心,棄上清,置于10%DMSO+20%FBS+DMEM 的凍存液中,直接放入順序降溫盒中,隔天放入液氮罐凍存。復(fù)蘇:從液氮罐中取出凍存管,迅速移入37℃水浴鍋輕輕搖動(dòng)使其融化,移入離心管中添加適量PBS混勻,1 000 rpm×3min 離心,棄上清,添加5 ml培養(yǎng)液混勻,置于培養(yǎng)瓶中常規(guī)培養(yǎng)。并鑒定凍存、復(fù)蘇對(duì)hUCMSCs的形態(tài)的影響。

1.2.2hUCMSCs上清液的提取

取第3、4 代hUCMSCs,計(jì)數(shù)2.4×105cell/5ml培養(yǎng)液/瓶,常規(guī)培養(yǎng),培養(yǎng)3天后,收集液體,0.22 μm濾膜過(guò)濾后,2 000 rpm×5 min 低溫離心,收集上清,-80℃保存。

1.2.3HSC-T6 細(xì)胞培養(yǎng)、傳代、凍存及復(fù)蘇

HSC-T6細(xì)胞培養(yǎng)在10%FBS+1%雙抗+89%DMEM-H的培養(yǎng)液中,于37℃,5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞達(dá)到80%融合時(shí),取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化傳代。 凍存和復(fù)蘇方法同1.2.1。

1.2.4實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HSC-T6細(xì)胞接種于培養(yǎng)板中,24 h后分為3 組,分別為對(duì)照組(10%FBS+1%雙抗+89%DMEM-H)、25%hUCMSCs 上清液組(10%FBS+1%雙抗+25%hUCMSCs上清液+64%DMEM-H)、50%hUCMSCs 上清液組(10%FBS+1%雙抗+50%hUCMSCs上清液+39%DMEM-H)。

1.2.5hUCMSCs上清液對(duì)HSC-T6細(xì)胞形態(tài)的影響

將HSC-T6按2×104細(xì)胞/1 ml/孔,接種于24孔板中,按1.2.4中的實(shí)驗(yàn)分組,分別于培養(yǎng)0 h、24 h、48 h后,顯微鏡下觀(guān)察其生長(zhǎng)狀態(tài)和形態(tài)變化。

1.2.6MTT檢測(cè)hUCMSCs上清液對(duì)HSC-T6細(xì)胞增殖的影響

HSC-T6以4×104細(xì)胞/ml,每孔100 μl接種于96 孔板中。按2.4中的分組,設(shè)置4 個(gè)板,每組設(shè)6 復(fù)孔,分別用于檢測(cè)細(xì)胞貼壁后培養(yǎng)12 h,24 h,36 h,48 h 的細(xì)胞增殖情況。 在達(dá)到培養(yǎng)時(shí)間前4 h進(jìn)行MTT 檢測(cè)。每孔加入5 g/L 的MTT 溶液20 μl,作用4 h后棄上清。每孔加入DMSO 溶液150 μl,溶解形成的甲臜結(jié)晶。作用10-20 min后,在分光光度計(jì)490 nm 波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光值。以A490 下的吸光度值代表細(xì)胞的相對(duì)數(shù)量,反映細(xì)胞增殖情況。

1.2.7Annexin V-FITC/PI 雙染檢測(cè)hUCMSCs上清液對(duì)HSC-T6凋亡的影響

將HSC-T6按2×104細(xì)胞/1 ml/孔,接種于24孔板中,按1.2.4中的實(shí)驗(yàn)分組,培養(yǎng)48 h。

(1)各組細(xì)胞用不含EDTA 的胰酶消化后,300 g,4℃離心5 min 收集細(xì)胞。

(2)用預(yù)冷的PBS 洗滌細(xì)胞2 次,每次均需300 g,4℃離心5 min。收集1-5×105細(xì)胞。

(3)加入100 μl 1×Binding Buffer 重懸細(xì)胞。

(4)加入5 μl Annexin V-FITC 和5 μl PI Staining Solution,輕輕混勻。

(5)避光、室溫反應(yīng)10 min。

(6)加入400 μl 1×Binding Buffer,混勻。

(7)滴1滴用Annexin V-FITC/PI 雙染的細(xì)胞懸液于載玻片上,蓋上蓋玻片。在熒光顯微鏡下用雙色濾光片觀(guān)察。Annexin V-FITC 熒光信號(hào)呈綠色,PI 熒光信號(hào)呈紅色。

1.2.8免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)hUCMSCs上清液對(duì)HSC-T6 細(xì)胞TGF-β1、α-SMA 表達(dá)的影響

HSC-T6以2×105細(xì)胞/ml/每孔接種于帶有細(xì)胞載玻片的24孔板中,按1.2.4中分組情況,培養(yǎng)48 h后,取出載玻片,采用免疫組化SP染色方法,按說(shuō)明書(shū)要求操作,進(jìn)行TGF-β1、α-SMA抗體染色,TGF-β1的一抗稀釋為1∶600、α-SMA的一抗稀釋為1∶800,DAB顯色。染色完成后顯微鏡下觀(guān)察并分析TGF-β1、α-SMA的陽(yáng)性表達(dá)情況。

1.2.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS19.0 軟件計(jì)算每組數(shù)據(jù)的均值和方差,所得結(jié)果均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(means±SD)表示,采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,當(dāng)P<0.05時(shí)表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組織塊貼壁法培養(yǎng)hUCMSCs 細(xì)胞的形態(tài)

組織塊貼壁后1周可見(jiàn)散在、貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞集落。原代細(xì)胞培養(yǎng)需10-14 d,傳代后在3-5 d細(xì)胞需再次傳代,細(xì)胞低密度時(shí)長(zhǎng)成扁平單層細(xì)胞,細(xì)胞生長(zhǎng)密度增加趨于融合時(shí),細(xì)胞形態(tài)變得細(xì)長(zhǎng),形態(tài)類(lèi)似成纖維細(xì)胞,呈平行排列生長(zhǎng)或旋渦狀生長(zhǎng),凍存復(fù)蘇后細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)狀況穩(wěn)定(圖1)。按照課題組已發(fā)表的論文鑒定為MSCs[10,11]。

2.2 hUCMSCs上清液對(duì)HSC-T6 細(xì)胞形態(tài)的影響

對(duì)照組HSC-T6細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)、呈星形或多邊形伸展?fàn)顟B(tài),胞內(nèi)含大量顆粒;隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞數(shù)量明顯增加。(見(jiàn)圖2 A1、 A2、A3);25%hUCMSCs上清液組HSC-T6細(xì)胞,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞突起減少,細(xì)胞數(shù)目減少(見(jiàn)圖2 B1、B2、B3);50%hUCMSCs上清液組在24 h、48 h與0 h對(duì)比發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)更加不規(guī)則,細(xì)胞體積減小、突起減少明顯,細(xì)胞數(shù)量明顯減少 (見(jiàn)圖2 C1、C2、C3)。

2.3 hUCMSCs上清液對(duì)HSC-T6 細(xì)胞增殖的影響

MTT結(jié)果分析顯示(表1),12 h時(shí)3組細(xì)胞數(shù)量無(wú)明顯差異(P>0.05)。培養(yǎng)24 h后,25% hUCMSCs上清液組、50% hUCMSCs上清液組HSC-T6 細(xì)胞的增殖受到抑制,與對(duì)照組相比,均差異顯著(P<0.05);培養(yǎng)36 h后,25% hUCMSCs上清液組、50% hUCMSCs上清液組與對(duì)照組相比,HSC-T6 細(xì)胞的增殖明顯受到抑制,差異顯著(P<0.05);培養(yǎng)48 h后,25%hUCMSCs上清液組與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05),50%hUCMSCs上清液組和對(duì)照組相比差異性極其顯著(P<0.001),25%hUCMSCs上清液組和50%hUCMSCs上清液組相比差異性極其顯著(P<0.001)。

A:傳代培養(yǎng)24 h的 hUCMSCs B:傳代培養(yǎng)48 h的hUCMSCsC:傳代培養(yǎng)72 h 的hUCMSCs D:復(fù)蘇后培養(yǎng)96 h的hUCMSCs

A1、A2、A3分別為對(duì)照組0 h、24 h、48 h;B1、B2、B3分別為25% hUCMSCs上清液組0 h、24 h、48 h;C1、C2、C3分別為50% hUCMSCs上清液組0 h、24 h、48 h

圖2 hUCMSCs上清液對(duì)HSC-T6 細(xì)胞形態(tài)的影響

*:與對(duì)照組比較P<0.05;**:與對(duì)照組比較P<0.01;***:與對(duì)照組比較P<0.001;#:與25% hUCMSCs上清液組比較P<0.05;△:與25% hUCMSCs上清液組比較P<0.001。

2.4 hUCMSCs上清液對(duì)HSC-T6 細(xì)胞凋亡的影響

Annexin V-FITC/PI 雙染顯示綠色、紅色熒光的細(xì)胞分別為早期、晚期凋亡細(xì)胞。對(duì)照組HSC-T6 細(xì)胞綠色熒光、紅色熒光的細(xì)胞較少(圖3 A、B、C)。 25%hUCMSCs上清液組、50%hUCMSCs上清液組凋亡的細(xì)胞數(shù)量均增多(圖3D、E、F、 G、H、I),凋亡細(xì)胞百分率與對(duì)照組相比,均明顯增加(圖3J),差異顯著(P<0.01)。

A、B、C 為對(duì)照組;D、E、F為25% hUCMSCs上清液組;G、H、I為50% hUCMSCs上清液組 J為3組凋亡細(xì)胞百分率對(duì)比圖**:與對(duì)照組相比P<0.01

圖3AnnexinV-FITC/PI雙染檢測(cè)hUCMSCs上清液對(duì)HSC-T6細(xì)胞凋亡的影響

2.5 hUCMSCs上清液對(duì)HSC-T6 細(xì)胞中TGF-β1、α-SMA 表達(dá)的影響

TGF-β1和α-SMA的陽(yáng)性表達(dá)均表達(dá)在HSC-T6 細(xì)胞胞漿內(nèi),DAB顯為黃色。25%hUCMSCs上清液組(見(jiàn)圖4B)、50%hUCMSCs上清液組(見(jiàn)圖4C)和對(duì)照組(見(jiàn)圖4A)相比,25%hUCMSCs上清液組TGF-β1的陽(yáng)性表達(dá)減少,但無(wú)顯著性差異(P>0.05), 50%hUCMSCs上清液組TGF-β1的陽(yáng)性表達(dá)明顯減少,差異顯著(P<0.05)(見(jiàn)圖4H); 25%hUCMSCs上清液組(圖4E)、50%hUCMSCs上清液組(圖4F)和對(duì)照組(圖4D)相比,25%hUCMSCs上清液組α-SMA的陽(yáng)性表達(dá)減少,但無(wú)顯著性差異(P>0.05),50%hUCMSCs上清液組α-SMA的陽(yáng)性表達(dá)明顯明顯減少,差異顯著(P<0.05)(見(jiàn)圖4H)。

A為對(duì)照組TGF-β1;B為25%hUCMSCs上清液組TGF-β1;C為50%hUCMSCs上清液組TGF-β1 D為對(duì)照組α-SMA;E為25%hUCMSCs上清液組α-SMA;F為25%hUCMSCs上清液組α-SMA;H為3組平均光密度對(duì)比圖*:與對(duì)照組比較P<0.05

圖4hUCMSCs上清液對(duì)HSC-T6細(xì)胞中TGF-β1、α-SMA表達(dá)的影響

3 討論

肝纖維化[12,13]是由各種致病因素引起肝細(xì)胞變性、壞死,導(dǎo)致炎癥反應(yīng),刺激纖維組織異常增生而形成的病理過(guò)程,我國(guó)是世界上慢性肝病發(fā)病率最高的地區(qū)之一,目前慢性肝病的治療缺乏有效措施,因而急需研究和探索新的肝病治療技術(shù)[14,15]。

目前研究表明,肝纖維化過(guò)程是可逆的[16,17],肝星狀細(xì)胞的異常激活并導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)在肝內(nèi)過(guò)量積聚是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)[18,19]。抑制肝星狀細(xì)胞的增殖或促進(jìn)其凋亡,抑制其分泌細(xì)胞外基質(zhì)或促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)降解,是阻止或逆轉(zhuǎn)肝纖維化進(jìn)程的關(guān)鍵[20-22]。

本研究通過(guò)組織塊貼壁法獲得的細(xì)胞,經(jīng)形態(tài)學(xué)、表面抗原、分化能力等鑒定為間充質(zhì)干細(xì)胞,可常規(guī)凍存、復(fù)蘇。通過(guò)hUCMSCs上清液與HSC-T6共培養(yǎng)的方法檢測(cè)hUCMSCs上清液對(duì)HSC-T6細(xì)胞的影響,MTT結(jié)果表明,hUCMSCs上清抑制HSC-T6的增殖,且與hUCMSCs上清液的濃度與時(shí)間成正比。Annexin V-FITC/PI 雙染方法檢測(cè)表明,hUCMSCs上清液促進(jìn)HSC-T6 細(xì)胞凋亡,且hUCMSCs上清的濃度越高,HSC-T6 細(xì)胞凋亡比率越高。這表明,hUCMSCs上清液可明顯抑制HSC-T6 細(xì)胞的生長(zhǎng)。

在此過(guò)程中,hUCMSCs上清液是否可抑制肝星狀細(xì)胞的激活?α-SMA是肝星狀細(xì)胞活化的標(biāo)志蛋白,為此,本研究檢測(cè)了HSC-T6 細(xì)胞α-SMA的表達(dá)。免疫組化結(jié)果顯示,50%hUCMSCs組α-SMA 的表達(dá)明顯降低,這表明,hUCMSCs上清液可抑制HSC-T6 細(xì)胞的活化。

TGF-β1是炎癥條件下誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞活化的重要信號(hào)分子,TGF-β1激活后,能夠快速與肝星狀細(xì)胞表面的受體相結(jié)合,導(dǎo)致肝星狀細(xì)胞激活,在TGF-β1持續(xù)刺激下造成細(xì)胞外基質(zhì)(如膠原纖維)的大量合成[12],形成肝纖維化。hUCMSCs上清液抑制肝星狀細(xì)胞活化的作用機(jī)制是否與其能抑制TGF-β1的表達(dá)相關(guān)?為此,本研究檢測(cè)了hUCMSCs上清液對(duì)HSC-T6 細(xì)胞TGF-β1表達(dá)的影響。免疫組化結(jié)果顯示,50%hUCMSCs上清液組HSC-T6 細(xì)胞TGF-β1的表達(dá)較對(duì)照組明顯降低,這表明,hUCMSCs上清液可明顯抑制HSC-T6 細(xì)胞TGF-β1的表達(dá)。

上述結(jié)果表明,一方面,hUCMSCs上清液能夠抑制HSC-T6 細(xì)胞的生長(zhǎng)、促進(jìn)其凋亡,使活化的肝星狀細(xì)胞數(shù)量下降;另一方面,hUCMSCs上清液能夠抑制TGF-β1在活化的肝星狀細(xì)胞的表達(dá),則抑制了TGF-β1 與肝星狀細(xì)胞表面的受體相結(jié)合,導(dǎo)致活化的肝星狀細(xì)胞合成細(xì)胞外基質(zhì)的能力下降。hUCMSCs上清液通過(guò)上述兩方面的作用,抑制了HSC-T6細(xì)胞的生長(zhǎng)。

猜你喜歡
貼壁星狀胞外基質(zhì)
貼壁風(fēng)方式對(duì)鍋爐壁面氣氛及燃燒特性的影響*
肝巨噬細(xì)胞調(diào)控肝星狀細(xì)胞活化影響肝纖維化的研究進(jìn)展
高硫煤四角切圓鍋爐貼壁風(fēng)傾角對(duì)水冷壁 高溫腐蝕影響研究
基于“土爰稼穡”探討健脾方藥修復(fù)干細(xì)胞“土壤”細(xì)胞外基質(zhì)紊亂防治胃癌變的科學(xué)內(nèi)涵
缺氧誘導(dǎo)因子-1α對(duì)肝星狀細(xì)胞影響的研究進(jìn)展
The Six Swans (II)By Grimm Brothers
脫細(xì)胞外基質(zhì)制備與應(yīng)用的研究現(xiàn)狀
660MW超超臨界鍋爐高速貼壁風(fēng)改造技術(shù)研究
球囊后擴(kuò)張同時(shí)推注對(duì)比劑評(píng)估支架貼壁的血管內(nèi)超聲評(píng)價(jià)
松弛素對(duì)馬兜鈴酸誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞MMP-9/TIMP-1 表達(dá)的影響