張新燕 孫夢嬌 原鉑堯 孫靜潔 王滿俠

(蘭州大學(xué)第二醫(yī)院，蘭州730000)

多發(fā)性硬化(Multiple sclerosis，MS)是一種世界性分布的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central nervous system，CNS)白質(zhì)脫髓鞘疾病[1]，是遺傳易感性與環(huán)境因素(包括感染、吸煙、維生素D缺乏、肥胖等[2,3])共同作用導(dǎo)致的自身免疫性疾病，神經(jīng)退行性變與炎性脫髓鞘是其主要的病理特征[4]，在全球約累及250萬人[5]，異常的免疫攻擊是MS研究和治療的切入點(diǎn)，多種免疫細(xì)胞(淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等)及細(xì)胞因子(抗體、補(bǔ)體等)參與針對軸突髓鞘發(fā)生的病理過程。新一代基因測序技術(shù)、生物信息學(xué)等發(fā)現(xiàn)的200余個(gè)易感基因中有近1/3位于主要組織相容性復(fù)合體(Major histocompatibility complex，MHC)編碼的人白細(xì)胞抗原(Human leukocyte antigen，HLA)上，但遺傳危險(xiǎn)因子僅約占整個(gè)疾病危險(xiǎn)因素的30%[6，7]，流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)幾乎100%MS患者均有EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)感染史[8]。在EBV作用機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn)，EBV感染的B細(xì)胞對抗原分子有保護(hù)作用，這種保護(hù)作用可能是通過瓜氨酸化實(shí)現(xiàn)。

1 瓜氨酸化機(jī)制

1.1瓜氨酸化 瓜氨酸化(Citrullination)是一種可在正常代謝中觀察到的轉(zhuǎn)錄后修飾(Post-translational modification，PTM)，可見于細(xì)胞凋亡、終末期分化、細(xì)胞增殖等過程[9]，但是異常的瓜氨酸化可以轉(zhuǎn)變自身抗原表位而激發(fā)自身免疫異常導(dǎo)致自身免疫性疾病[10]。簡單地講，瓜氨酸化就是將蛋白質(zhì)殘基末端的精氨酸在肽?；彼崦搧啺访?Peptidyl arginine deininase，PAD )作用下轉(zhuǎn)化為瓜氨酸[9]。目前人體內(nèi)共發(fā)現(xiàn)5種PAD(即PAD1、2、3、4、6)，PAD的活性與高于正常水平的Ca2+濃度相關(guān)，細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平達(dá)10-5mol/L時(shí)[11,12]，PAD中的半胱氨酸殘基結(jié)合到精氨酸的胍基上，脫去一分子氨，形成四面內(nèi)旋的過渡狀態(tài)，后利用水分子的親核性恢復(fù)半胱氨酸殘基并形成一個(gè)酮基，從而使精氨酸轉(zhuǎn)化為瓜氨酸[9]，見圖1。在這個(gè)過程中，氨基酸的電荷和氫基含量，甚至是蛋白質(zhì)的一/二/三級結(jié)構(gòu)都發(fā)生了改變，所以蛋白質(zhì)的抗原性也發(fā)生了改變，使得自身免疫性T/B細(xì)胞對蛋白質(zhì)的識(shí)別敏感度改變，免疫耐受遭到破壞，激發(fā)適應(yīng)性免疫應(yīng)答[10]。

圖1 瓜氨酸化作用Fig.1 Citrullination

關(guān)于瓜氨酸化抗原表位的研究多是關(guān)于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)，但對這種改變后的抗原識(shí)別在其他自身免疫性疾病中導(dǎo)致免疫耐受破壞也有相關(guān)性，這其中就包括MS。

1.2瓜氨酸化與自噬 自噬(Autophagy)是一種進(jìn)化上高度保守的細(xì)胞溶酶體降解途徑，是細(xì)胞降解和回收利用細(xì)胞內(nèi)生物大分子與細(xì)胞器的“自清”過程，普遍存在于真核細(xì)胞中[12]。自噬曾經(jīng)被認(rèn)為主要參與細(xì)胞凋亡，但新的發(fā)現(xiàn)提示自噬也有將細(xì)胞內(nèi)多余或受損的細(xì)胞器、折疊蛋白和侵入的病原體運(yùn)送至溶酶體進(jìn)行消化降解的作用，參與細(xì)胞增殖/分化過程所需的細(xì)胞質(zhì)重排，同時(shí)，自噬因?yàn)椴煌潭葏⑴c細(xì)胞抗原呈遞過程及其相關(guān)細(xì)胞，如APC、T細(xì)胞增殖分化，也影響著機(jī)體的免疫應(yīng)答[13]。自噬的類型主要包括微自噬(Mitophagy)、巨自噬(Macrophagy)和伴侶介導(dǎo)的自噬(Chaperone-mediated autophagy)[14]，本文中的自噬主要指巨自噬。

自噬在細(xì)胞內(nèi)通過自噬相關(guān)基因(Aytophagy-relative gene，Atg)協(xié)助誘導(dǎo)形成一種雙凹的雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體(Autophagysome)[12]，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的微管結(jié)合蛋白1A/1B-輕鏈3(Microtubule-associated protein 1A/1B light chain 3，Atg8/LC3)可通過與磷脂酰乙醇胺(Phosphatidylethanolamine，PE)結(jié)合而插入這些膜結(jié)構(gòu)。在與溶酶體結(jié)合前，自噬體也會(huì)與一些內(nèi)體融合，內(nèi)體中含有待降解的蛋白、內(nèi)吞作用后形成的受體-配體復(fù)合物等，形成的融合物被稱作自噬內(nèi)涵體(Amphisome)。鈣離子是自噬體形成、成熟過程中重要的因素之一[15]，可沉積在自噬體、自噬內(nèi)涵體中，形成高Ca2+環(huán)境[16]。而正是這種高鈣濃度可以在自噬體、自噬內(nèi)涵體中活化PADs而促進(jìn)其中的蛋白分子高瓜氨酸化[9]。自噬內(nèi)涵體可以與溶酶體結(jié)合，借助溶酶體中的蛋白水解酶降解內(nèi)容物。

2 瓜氨酸化作用參與MS發(fā)病機(jī)制

2.1瓜氨酸化與MS抗原代謝 MS的病理過程是建立在免疫細(xì)胞(淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞)、分子(抗體、補(bǔ)體因子)對髓鞘損傷的基礎(chǔ)上[17]，以小鼠/猿類制作的動(dòng)物模型顯示這些損傷主要由各類專職T細(xì)胞引起，而疾病的進(jìn)展主要是免疫系統(tǒng)對一種髓鞘成分——髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(Myelin/oligodendrocyte glycoprotein，MOG)的排斥作用引起的[18]?？捎肕OG作為抗原制作實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(Experimental autoimmune encephalo-myelitis ，EAE)動(dòng)物模型，MOG24-36多肽片段通過激活CD4+Th1細(xì)胞引發(fā)CNS炎性改變。

B細(xì)胞可以在抗原滴度很低的情況下通過其受體捕獲抗原，外源性蛋白質(zhì)自身抗原的加工需要核內(nèi)體和部分內(nèi)溶酶體的蛋白酶參與，含有被捕獲抗原的內(nèi)體與含有蛋白水解酶的溶酶體融合，如組織蛋白酶G(Cathepsin，CatG)[19]，將抗原降解成適宜長度的多肽，后被裝配到MHC-Ⅱ類分子上，表達(dá)于CD4+T細(xì)胞表面并被提呈。這與自噬途徑有許多交叉點(diǎn)。研究指出，EBV感染可以上調(diào)B細(xì)胞表面的APC相關(guān)標(biāo)識(shí)物的表達(dá)并激發(fā)抗原交叉提呈[20]?！瓸ert等在研究EBV感染后放大B細(xì)胞的抗原提呈功能時(shí)發(fā)現(xiàn)，EBV感染后的B細(xì)胞可以保護(hù)MOG抗原免于被代謝， 而后通過交叉抗原提呈至自身免疫性MHC-E限制性CD8+CD56+T細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)這個(gè)過程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)就是自噬。

抗原分子被EBV感染后的B細(xì)胞捕獲后被內(nèi)吞形成內(nèi)體，MOG35-51中含有一個(gè)可以與自噬體表面錨定位受體LC3-II結(jié)合的序列——LC3-interacting region (LIR) motif ([W/F/Y]xx[L/I/V][21])相互重疊的片段F44xxV47(F-LIR)，其酸性殘基(E，D，S)與側(cè)鏈芳香基F共同形成了與LC3上疏水口袋(Hydrophobis pocket，HP1)的結(jié)合力[22]， 介導(dǎo)上述自噬參與進(jìn)MOG代謝。MOG40-48多肽中的Arg41/Arg46為CatG降解的切割位點(diǎn)，自噬體中的高Ca2+環(huán)境活化PADs誘導(dǎo)其中的精氨酸(Arg41/Arg46)瓜氨酸化而不能被CatG有效降解[20]，見圖2，使得B細(xì)胞可以將這些自身抗原交叉遞呈給 CD8+CD56+T 細(xì)胞，觸發(fā)免疫異常。研究表明通過以絨猿為模型的實(shí)驗(yàn)得到了更進(jìn)一步的結(jié)果：周圍免疫系統(tǒng)中的B細(xì)胞也許可以通過破壞MOG40-48抗原表位而阻止自身免疫性T細(xì)胞被激活，而EBV感染可以使這種免疫耐受被打破，通過自噬體存活的抗原被呈遞給HLA-E并激活自身免疫活性的CTLs[20]，促進(jìn)自身免疫發(fā)生。

圖2 MOG35-55結(jié)構(gòu)及CatG作用位點(diǎn)Fig.2 Structure of MOG35-55 and action sites of CatG

他們的研究進(jìn)一步明確了是Arg46殘基參與進(jìn)F-LIR序列與自噬體所含的LC3-Ⅱ產(chǎn)生聯(lián)系，當(dāng)這種聯(lián)系減弱時(shí)，瓜氨酸化的表位也會(huì)被降解，所以Arg46也許是瓜氨酸化最重要的作用位點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)也證明，當(dāng)用雷帕霉素增加自噬體形成時(shí)，MOG35-55的保護(hù)也增加，用3-MA抑制自噬，其降解增強(qiáng)[22]。由此可以形成一種新的假設(shè)：EB病毒感染可以通過自噬調(diào)節(jié)疾病相關(guān)的髓鞘自身抗原加工，即在自噬的背景基礎(chǔ)上，MOG瓜氨酸化是MS病理過程中關(guān)鍵的抗原表位改變。這一特點(diǎn)與病毒感染是觸發(fā)自身免疫異常的危險(xiǎn)因素的推斷也相符合。

2.2瓜氨酸化抗原識(shí)別與MS 異常的瓜氨酸化不僅可以改變抗原代謝，同時(shí)還能影響抗原提呈[9]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，易感HLA-DR與精氨酸和瓜氨酸殘基結(jié)合時(shí)表現(xiàn)出了不同的錨定效力[23]。RA相關(guān)的危險(xiǎn)易感HLA-DRB1* 0401/* 0404 蛋白上關(guān)鍵抗原結(jié)合槽(Gly-lys/arg-ala-ala，QQRAA/QKRAA/KKRA-A)，稱為 RA 共同表位(SE)對瓜氨酸表現(xiàn)出更高的親和力[24]，而非易感者沒有或不明顯，但是這種不同在HLA-DR蛋白有限的情況下不能復(fù)制，這提示了瓜氨酸化的作用也是有限的。故瓜氨酸化可以改變HLA-DR結(jié)合端結(jié)合位點(diǎn)與配體的親和力，可以使瓜氨酸化抗原表位被優(yōu)先提呈給CD4+T細(xì)胞，這很大程度是由于在與HLA-DR結(jié)合槽結(jié)合時(shí)瓜氨酸殘基比精氨酸在相對大小和電荷方面更具靈活度和兼容性[25]。

從病因?qū)W角度出發(fā)，MS也是一種HLA相關(guān)的自身免疫性疾病，其與蛋白質(zhì)瓜氨酸化也有關(guān)系。在炎性神經(jīng)組織中，當(dāng)髓鞘基礎(chǔ)蛋白(Myelin basic protein，MBP)過度瓜氨酸化時(shí)，髓鞘變的缺乏抵抗力，增加了髓鞘的不穩(wěn)定性，這種過度瓜氨酸化被認(rèn)為是由于PDA2/4在PAD2啟動(dòng)子低甲基化后所致的酶過度表達(dá)所致的[26]。過去的研究顯示瓜氨酸化蛋白在MS中有一定免疫作用；近期新的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)用瓜氨酸化MBP刺激MS患者可以大量產(chǎn)生一種新的T細(xì)胞系，這種T細(xì)胞系對瓜氨酸化MBP的敏感性高于未修飾的蛋白，類似的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MS患者腦脊液和血清中存在識(shí)別瓜氨酸化MBP的抗體[27]。最有說服力的證據(jù)就是MS最易感的因子HLA-DRB1*15∶01和HLA-DRB5*01∶01在關(guān)鍵的HLA結(jié)合殘基對瓜氨酸化抗原表位提呈也表現(xiàn)出優(yōu)先性[9]。

3 總結(jié)與展望

MS的病理過程一直是疾病研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)，多種假說、多個(gè)位點(diǎn)也反映出病理的復(fù)雜性。抗原瓜氨酸化是抗原瓜氨酸化機(jī)制在MS疾病過程中的參與尚未得到全面深入的研究，有很多細(xì)節(jié)還亟待補(bǔ)充，但是在其他自身免疫性疾病，如RA、SLE等疾病中已有成果。也許對此方向的深入研究可以為疾病治愈提供了新的思路和可能。